[转帖]组织相容性

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第一节 主要组织相容性系统

根据组织相容性的重要程度，可将其分为主要的和次要的两大类。人类红细胞ABO系统和白细胞HLA系统是两类主要组织相容性系统（MHS）。

在研究小鼠的移植排斥反应时，Snell（1956）首先引入主要组织相容性基因的概念。主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）基因紧密连锁，位于第6号染色体的短臂内

1958年法国Dausset用血清学技术检出第一个人类白细胞抗原（HLA），并以其相继的开拓性研究，于1980年获得诺贝尔奖，人类白细胞新抗原的相继发现与检出，为选择匹配的供者和受体提供了依据，大大减少了供、受体间免疫遗传学上的差异。造血干组细胞移植的发展也是随着移植免疫学的发展而前进的。

一、HLA系统

HLA是由一组定位于人类第6号染色体短臂P21区上一系列紧密相连的基因复合体编码的抗原，在绝大部份细胞膜上均有表达。这组基因群所编码的抗原与移植物排斥有关（曾被称为移植抗原），参与控制免疫应答，免疫识别，并调节免疫细胞各亚群之间的相互作用，因而也称这一系统为主要组织相容性复合体（Major Histocompatiblity Complex；MHC）。小鼠的MHC为H-2系统，人类的MHC即HLA基因区。

二、HLA的多态性

    HLA是人体多态性最丰富的基因系统。传统上，HLA基因分为Ⅰ类（HLA-A，B，C）、Ⅱ类（HLA-DR，DQ，DP）和Ⅲ类（补体基因）。在产物结构、表达方式、组织分布和功能上各不相同。自从引入重组DNA技术之后，HLA的结构和功能分析出现了新的突破，引出了新认识，

HLA新的基因座位及等位基因正在不断发现，每条染色体上不同座位基因紧密联锁在一起组成单倍型（haplotype），从亲代遗传给子代，每个基因座位上不同等位基因的产物表现在细胞膜上构成个体的HLA表现型（phenotype）。HLA不同座位等位基因之间有明显的联锁不平衡（Linkage Disequilibrium），因而HLA的基因型和表现型是相当复杂和庞大的。此外，大量的人类学研究发现不同人种或不同地理区域往往有不同的主导单倍型。它们可以是已知等位基因以不同方式进行结合，也可以是出现一些人种“特有的”等位基因。这是进化和长期自然选择的结果。HLA的某些表型在特定的人群中有相对高的频率。例如中国汉人（包括主要少数民族）HLA-A2，A9，A11和HLA-B40，B15，B13的表现较为常见，南北地区的频率又各不相同，因此在临床上同一民族和地区间寻找无血缘关系的HLA表型相合供者（Unrelated Bone Marrow Donor，URD）的机率较高。

三   HLA的家系遗传规律

HLA是由第6对染色体短臂上P21.31区一系列紧密连锁的基因复合体编码的细胞膜分子。生殖细胞内的单倍体（haplotype）作为1个遗传单位，传递给子代，如父亲是a，b两个单倍体，母亲是c，d两个单倍体，在生殖细胞减数分裂过程中，父，母双方的两个单倍体各只有一个单倍体传给子代，因此，子代有四种组合形式：即ac，ad，bc，bd。亦即是子代从父母将各获得一个单倍体，如用父母作供体，一般说来与其子代总有一个单倍体相同，即所谓HLA半相合。而在同胞兄弟姐妹间二个单倍体相合、不相同或只有一个单倍体相同的机率就不一样了。

四   HLA的生物学功能

HLA的基因功能和免疫调控研究近年来发展很快。80年代中期Strominger实验室首次阐明HLA-A2分子空间构型中的抗原部位，迅速导致提出MHC通过三分子复合体（trimolecular complex）调节特异性免疫反应的重要概念，原来抗原经APC处理后其关键性片段结合MHC  = 2 \* ROMAN II类抗原被提交给T细胞受体，抗原片段一方面以表位（epitope）和TCR结合，同时以其配位（agretope）结合MHC分子，启动免疫应答。另有三类分子辅佐上述三分子复合体行使功能。一是分别表达于Th/Ti和Ts/Tc的CD4和CD8分子，相应配体是APC及靶细胞上的MHC  = 2 \* ROMAN II类和 = 1 \* ROMAN I类抗原的单态（monomorphic）部位，这一对辅佐分子和相应配体的结合是形成MHC约束性的基础；二是CD3分子和TCR共同组成T细胞受体复合结构，传递T细胞的活化信息；三是粘附分子包括整合素家族成员参与T细胞和APC，T细胞和靶细胞的相互作用，其中表达于T细胞和巨噬细胞上的受体和配体分子包括LAF-1，LAF-2和LAF-3等。前述由MHC基因产物参与的三分子复合体及多种辅佐分子，是免疫识别和免疫应答的核心。

控制移植的免疫反应

    HLA系统与组织器官移植的排斥反应密切相关。供、受体之间HLA抗原是否相容，直接影响移植效果。移植抗原的相容程度越高，移植的活存率越高。特别认识到HLA  = 2 \* ROMAN II类基因包括DP的相容性对移植器官的长期存活是极为重要的，对骨髓移植避免GVHD尤其如此。HLA完全相配的同胞间移植的活存率高于HLA相配的无关个体。

（一）自我识别

    机体的免疫功能表现在自我识别、排除异已，只有自我识别，才能维持生命。动物实验已提示，MHC  = 1 \* ROMAN I类抗原与维持机体的个体性、完整性等有关； = 2 \* ROMAN II类抗原主要调节免疫细胞间的协同作用，使机体的免疫功能更为协调。

（二）限制或约束作用

    70年代Ainkernagal和Doherty发现T细胞参与的特异性杀伤受MHC  = 1 \* ROMAN I类基因约束：T杀伤细胞同时要识别靶细胞上的外表抗原和本身的HLA-A、B抗原，只有T杀伤细胞和靶细胞的HLA-A、B抗原相配，才能发挥杀伤作用。Shevch和Rosenthal发现T细胞激活中T细胞与巨噬细胞相互作用受 = 2 \* ROMAN II类基因约束：T辅助细胞被巨噬细胞提呈的抗原激活，进而协助B细胞增殖与分化产生抗体，也需要D、DR、DQ、DP相配，这说明免疫细胞间的相互作用，受着HLA系统的约束。

（三）免疫功能相关基因

补体组分C2、C4、BF等基因与HLA连锁，控制补体系统活化途径和备解素途径。TNFα与急性GVHD密切相关，可能是GVHD发病过程中的主要环节。此外如前述的BAT基因、肽链转送基因TAP和蛋白酶体基因LMP、伪或假基因等，可能对HLA的表达和免疫反应具有调节功能。

HLA-A、B、C基因产物属于 = 1 \* ROMAN I类产物，公布于几乎所有的细胞表现，这种分布特点提示它们具有一种普遍性的生物学意义。D、DR、DQ、DP基因产物为 = 2 \* ROMAN II类产物，主要存在于B细胞、巨噬细胞、母细胞化的T细胞（而非小T细胞）等免疫活性细胞上，也存在于上皮细胞、朗格罕细胞上，不表达于精子细胞。

      五   HLA的分型技术

    自1958年Dausset用血清学技术检出第一个HLA抗原以来，目前所用分析和检测手段，或都侧重其基因产物，包括血清学分型、单克隆抗体分型、细胞学分型（HTC、PLT、MLC等）、表面抗原凝胶电泳，及血清成份电泳分析等。或者直接分析等位基因结构，已能够结合产物特异性，提出HLA基因分型或DNA分型的新概念，二者总称HLA分型，兹分述如下：

1．HLA-A、B、C、DR和DQ抗原的血清学测定

最常用的是Terasaki微量淋巴细胞毒方法，因有补体参与反应，又称补体依赖细胞毒试验（Complement dependent cytotoxicity）。

（一）原理

    淋巴细胞作为抗原与特异性抗体结合，在补体参与下，引起细胞损伤造成死亡，而淋巴细胞不带相应抗原则无此作用。染料如伊红可以进入死细胞，使整个细胞着色或者用双萤光染粒（吖啶橙/溴化乙锭），死细胞吸附吖啶橙（橙黄色），活细胞吸附溴化乙锭（绿色）。

（二）方法 

    常用的是用尼龙棉柱分离下T、B细胞，然后再以标准的微量淋巴细胞毒试验作HLA-A、B、C、DR、DQ分型。此方法已为国内大多数HLA专业实验室所采用，故不再赘述。分离T、B细胞的方法除用尼龙棉柱法外，还有免疫磁珠、萤光磁珠法，效果较好。方法中补体质量是重要关键，一般产张当地免补体最好先经过血小板吸收，国外提供的有Pelfreez公司、one lambda公司和Cb公司，须先经预实验，了解其强弱，以避免假阳性或假阴性。近年来国外对观察结果进行自动化检测，省时省力，但价格昂贵，尚不能普遍使用。此外HLA-DR、DQ抗血清有时也难得到，影响工作的进展。

2．HLA-D位点抗原的细胞学监测

一般采用混合淋巴细胞培养技术（mixed lymphocyte culture，MLC），不能用血清学方法。

（一）原理

    两个同种异体细胞（具有不同抗原）共同培养时，T细胞被激活，进行分化增殖。在转化过程中（DNA）摄取³H-TdR（胸腺嘧啶核苷），测³H-掺入值，就可知MLC反应程度。

    MLC技术有两种不同方法，一是双向MLC，两个个体淋巴细胞不作任何处理，直接混合培养，这时双方产生相互识别“非己”，均被激活；另一是单向MLC，一个细胞不作处理，另一个细胞用丝裂霉素C或照射处理，使其不能合成DNA，但有刺激能力，而无反应能力。

在MLC中应答反应细胞是T细胞，而B细胞则是刺激细胞，此外，内皮细胞、精子、单核细胞也可作为刺激细胞。

（二）方法  可参阅国内赵桐茂等介绍的第八届国际组织相容性讨论会所介绍的MLC技术^）。

过去认为MLC是检测DR和DQ的半定量方法，最近认为其它组织相容性抗原，特别是DP抗原也在MLC中起重要作用。

3．限制性片段长度多态性（RFLP）分型

4．PCR-RFLP分型

5．PCR-序列特异性核苷酸探针（Sequence specific Oligonucleotide Probes，SSOP或SSO）分型。

6．PCR-单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分型法

7．PCR-序列特异性引物（Sequence Specific Primers，SSP）分型

    PCR-SSP是近几年发展起来的HLA基因分型技术。各国学者通过分析各位点基因序列，设计出一系列引物具有等位基因特异性（ASP）、型特异性（GSP）或序列特异性（SSP），直接扩增出各种有序列差异的等位基因片段。引物和模板完全配合的扩增效率将远高于几个甚至单个碱基不合的扩增，而且只有一条引物的3’末端序列与模版有一个碱基的不配对，就不能扩增出特异性产物。最后通过电泳是否出现相应的扩增产物确定基因多态性。用于HLA基因分型时延伸为几种类似方法，统一归于PCR-SSP方法。有人用单一PCR-SSP，检出所有DR1-DR18血清型方法检出的特异性。有人先后设计出一系列引物用HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ等其他HLA区等位基因的检测，因而国外已有学者将PCR-SSP技术作为常规技术用于器官移植配型。有快速、方法简便、结果可靠等优点，但对杂合体分型时，在无其他方法对照时，分析结果复杂，仍有待进一步完善。

8．PCR指纹图分型法（PCR-Fingerprints）

9．PCR-难扩增突变系统（PCR -Amplification- Refractory-Mutation-System，PCR-ARMS）分型 ：

10．PCR-DNA序列测定（PCR-DNA Sequencing）

序列测定是分析基因结构最直观、最准确方法，将PCR扩增产物先克隆于M13噬菌体等，再进行序列分析或直接测序。序列测定可作为一种临床常规的HLA配型方法，用于无关个体骨髓移植供者的选择，以磁珠为固相载体，吸附生物素标记的PCR产物，用双脱氧链末端进行测序。但序列测定技术复杂，价格昂贵，多由专业实验室进行。

11．HLA-A抗原的三维结构模型预测GVHD的发生

采用HLA抗原三维结构的模型，对预测GVHD的发生作了探索。在对17例移植家系进行筛选时，发现了一个供、受体HLA-A位点不合的家系，临床移植后该患者发生了IV级GVHD。采用高分辩率巢式HLA-II 类PCR-SSP和DNA序列测定确定该患者的HLA-A位点发生了重组（A*6901→A*0201）。蛋白质三维结构的模型分析显示，供、受体差异抗原的空间构象存在明显差异，可能为移植后发生GVHD的分子基础，因而该HLA抗原三维结构的模型在预测移植后发生GVHD中具有重要意义。

第二节 移植前的组织配型

上文已述及Bortin在总结60年代BMT失败的经验时曾提到对HLA的认识不足，是重要因素之一，HLA配型是选择合适的HLA相合供者所必需。1970年以来，BMT成功率及远期活存率大为提高，HLA相合或供受体间免疫遗传学差异的减少是急慢性GVHD发生率减少、程度减轻和死亡率减低的关键问题。因此在一定意义上，可以说临床BMT的进展是与HLA研究的深入发展分不开的。

造血细胞移植前的组织配型，需要检查HLA-A, B,DR等三个座位上的基因。 由于每个座位上均有两个等位基因（抗原位点）, 因此最多可以有6个不同的基因。供受者对配型最理想的结果是6个基因（抗原位点）全合。如无HLA全相合供者, 有时可以选择不相合位点最少的的供者。

二、无血缘供者移植前的组织配型

无血缘供者选择需以HLA基因分型技术为基础, 如: 顺序特异性引物(SSP)和顺序特异性寡核苷酸探针(SSOP) 。 根据骨髓供者协会(WMDA)2001 年标准, 无血缘供者选择步骤包括：1. 需对供者检测HLA-A,B,DR三个座位上的对应于分解物水平的等位基因, 即*号后2位数。 2.  如配型相合则进一步行HLA-A,B,C和HLA II类抗原高分辨分型,即*号后4位数。

供者选择顺序:

1.HLA相合: HLA-A,B,C, DRB1，DQB1及其等位基因亚型(allele，*号后4位数)均相合。

2. 一个等位基因的亚型不相合。

2.1 不相合的等位基因亚型存在于HLA-A,B,C；

2.2不相合的等位基因亚型存在于HLA DRB1／DQB1；

3. HLA-A,B,C 有两个等位基因亚型不相合。

4. 一个抗原(等位基因)不相合。

4.1不相合的抗原存在于HLA-A,B,C;

4.2不相合的抗原存在于HLA DRB1／DQB1;

5. HLA-A,B,C一个抗原加一个等位基因不相合。

具备以下情况者最好重新选择供者:

1.细胞毒试验提示有抗供者细胞反应阳性

2.同一个抗原座位的两个等位基因亚型均不相合。如: 患者A*0101,A*0201, 供者A*0102 和A*0205。

3.供受者对不相合的抗原均为纯合子,故应视为两个抗原不合。例如: 患者A*0101 纯合子而供者A*0201 纯合子。

4.如果受者的纯合子存在于HLA-A,B,C中而供者为杂合子。如: 患者A*0101 纯合子, 供者A*0101,A*0201。

5.HLA I类(A,B,C) 和II(DRB1或DQB1)均存在等位基因亚型不相合。

注意：

1 HLA-A,B,C或DRB1的1个等位基因亚型不相合可增加移植死亡率； 1个以上的等位基因亚型不相合危险性叠加；而一个抗原不相合较之一个等位基因亚型不相合的危险性更高。

2 供受者不相合的HLA-A和B抗原无论是在具有血清学交叉反应组抑或在非交叉反应组，其移植后致排斥，GVHD和死亡的危险性是一样的。

三、亲缘HLA单倍体相合移植前的组织配型

亲缘HLA单倍体相合移植是指亲缘供者（患者父母或亲属）与患者共有一条相合的HLA单体，而另一条HLA单体不相合。不相合的HLA单体表型可以表现为：（与患者）完全相合（6／6相合）；1个或更多的抗原或等位基因亚型不相合（5／6～3／6相合）。供者选择步骤包括：

1 确定亲缘供受者之间HLA表型相合：HLA-A,B，C血清学配型；HLA-DRB1,DQB1为中－高分辨分型。

2 确定亲缘供受者之间HLA遗传型相合： 需有供受者以及父母的HLA配型资料：HLA-A, B，C血清学或高分辨配型；HLA-DRB1,DQB1为高分辨分型。

供者选择顺序：

1 HLA相合：供受者HLA-A,B,C以及DRB1,DQB1全相合。仅1个HLA-C或HLA－DQ等位基因或等位基因亚型不相合应视为1个抗原不相合。

2 有1个抗原不相合：供受者在那条不相合的HLA单体上有一个HLA-A,B,C或DRB1/DQB1抗原或等位基因亚型不相合。在有1个A,B,或DRB1不相合以外还有1个HLA-C和／或DQ抗原或等位基因亚型不相合时，不必计为第二个或第三个抗原不相合。

3 有两个或三个抗原不相合： 供受者不相合的HLA单体上存在两个或三个HLA－A,B或DRB1抗原／等位基因亚型不相合。应说明的是，由于HLA-C和DQ多位点不相合的意义尚未明了，故HLA-C和DQ抗原／等位基因亚型不相合不可视为两个或三个抗原不相合。

HLA系统属免疫学中的主要组织相容复合物（MHC，major histocompatibility  complex）。除MHC外，尚有次要的组织相容抗原（minor histocompatibility antigens， mAgs）。mAgs虽已日益受到重视，但目前对它的认识既不全面又欠深入，国际上并无统一的要求。

移植供者的选择

（1）供者的年龄需有一定范围，一般为8～65岁；（2）供者不应有明显的造血与免疫功能异常（血象有可疑者应作骨髓穿刺检查），恶性疾患或心、肾功能衰竭；（3）供者不应有败血症或活动的病毒血症。供者应常规作乙型与丙型肝炎相关检查；（4）供者应经HLA I类与II类抗原检测。选择供者宜遵循附表1所列的步骤。首选的供者为HLA完全相同的有血缘关系的供者（如HLA一致的同胞兄弟姐妹或父母）。至少在国内检索无HLA相同的非血缘供者或合适的库存脐带血的情况下，如有较强的干细胞移植适应症，则亦可考虑单倍型的骨髓移植，首先应选择HLA配型最佳的亲缘供者。其次，可考虑子女与母亲间的移植或选择同胞间NIMA型（指HLA配型不同抗原来自母亲，non—inherited maternal antigen），其次是母亲或同胞间的NIPA型（指HLA配型不同抗原来自父亲，non-inherited paternal antigen），最后是父亲或其他亲属作为供者。禁止应用HLA完全不相合者作为造血干细胞移植供者。

表1   异基因造血干细胞移植供者选择的顺序

顺序	HLA配型	供者
1	相合	亲属（兄弟姐妹等）
2.1	相合	非血缘
2.2	相合	脐血*
2.3	1/6不相合	亲属
3	1/6不相合	脐血*
4.1	2/6不相合	脐血*
4.2	半相合	子女与母亲之间/NIMA
4.3	半相合	NIPA
5	半相合	父亲

*需足够的细胞数量                   NIMA与NIPA见文中解释

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