【转载】关于征求《全国无偿献血表彰奖励办法（征求意见稿）》意见的函

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当SI上限和SI下限值〈 n2s 时，表示处于控制范围之内，可以继续进行测定，并重复以上计算；当SI上限 和 SI下限 有一值处于n2s 和 n3s 值之间时，说明该值在2s - 3s范围，处于"警告"状态；当SI上限 和 SI下限有一值 〉n3s 时，说明该值已在3s范围之外，属"失控"。数字处于"警告"和"失控"状态应舍去，重新测定该项质控品和病人样本。舍去的只是失控的这次数值，其它次测定值仍可继续使用。当检测的数字超过20次以后，可转入使用常规的质控方法进行质控。

4.4.5  室内质控图的使用：操作人员应对每批次室内质控实验结果进行确认，在室内质控图上描点，记录质控数据。利用质控规则判断每一分析批结果的在控和失控情况。

4.4.6  室内质控数据的管理
4.4.6.1  实验室应定期对所有检测项目的室内质控数据进行统计分析，对质控图进行评价和维护，以确保室内质控的有效运行。
4.4.6.2  实验室应定期对所有检测项目的室内质控数据、质控图以及失控报告单整理后进行存档。
4.5献血者血液检测后过程管理
4.5.1  检测报告的签发
4.5.1.1  检测结果的分析
    检测结果产生后，操作人员应对每批标本（包含完整质控的一次检测为一批）的实验过程和关键控制点进行检查，以确定该批结果的正确性和有效性。检查的内容至少包括：
4.5.1.1.1  实验室的环境条件，如温度、湿度是否正常；
4.5.1.1.2  使用的仪器设备工作是否正常运行；
4.5.1.1.3  使用的试剂是否正确，是否在效期内使用；
4.5.1.1.4  实验有无意外情况发生，如微板本底问题等；
4.5.1.1.5  试剂盒内含的阴性、阳性、空白对照是否符合试剂盒的要求；
4.5.1.1.6  室内质控品的使用是否正确，结果是否"在控"。
4.5.1.2  检测结论的判定
4.5.1.2.1  实验室应根据既定的判定规则，对每一份标本做出检测结论的判定。
4.5.1.2.2  实验室应采用计算机系统进行检测结果的传输和检测结论的判定，以减少手工操作误差。
4.5.1.3  检测报告应完整、明晰，符合《实验室质量管理规范》的相关要求。
4.5.1.4  检测报告的审核
    对检测结果进行汇总，形成检测报告后，应对报告进行最终的审核，以保证检测报告的正确和完整。审核结束，方能签发检测报告。审核内容至少包括：
4.5.1.4.1  所有类型检测标本的检测项目是否正确；
4.5.1.4.2  所有类型检测标本的数量是否正确；
4.5.1.4.3  室内质控状态的再确认；
4.5.1.4.4  初次反应性标本和复验标本的信息、数量和结果状态是否与原始检测记录相对应；
4.5.1.4.5  血型改型标本的信息、数量和结果是否与原始检测记录相对应；
4.5.1.4.6  纸载报告结果与电子报告结果是否相对应。
4.5.1.5  检测报告的签发
4.5.1.5.1  应由经过授权，具备相应资质的人员执行报告的签发。
4.5.1.5.2  报告签发人在报告发放之前应再次对检测报告进行确认。
4.5.1.5.3  应采用计算机系统进行检测结果和检测报告的传输，以减少手工操作误差。如需要，可增加手工报告方式。
4.5.1.5.4  如不能按照既定的检测周期发放报告，应及时与结果使用部门进行协调。
4.5.1.6  集中化检测报告要求
4.5.1.6.1  集中化检测报告的分析、结论的判定、报告、审核和签发同上。
4.5.1.6.2  集中化检测报告的签发应采用电子报告和纸载报告同时发放的方式，以保证检测委托方能够接收到正确无误的检测报告。
4.5.2  检测报告收回、更改和重新签发
4.5.2.1  检测报告的收回
4.5.2.1.1  发出的纸载报告或电子报告一旦发现有错，应立即报告实验室主管。由实验室主管或经授权人员实施报告收回、与相关部门协调和决定需要采取的进一步措施。
4.5.2.1.2  实验室应严格控制对检测报告的收回，只有经授权人员方可进行报告收回。
4.5.2.2  检测报告的更改
4.5.2.2.1  纸载报告的更改，由经授权的责任人进行更改和确认。更改时应注明更改的时间、日期和更改者的姓名。报告更改后，原内容还应清晰可辨。
4.5.2.2.2  电子报告的更改，由经授权的责任人进行更改和确认。计算机系统应记录报告更改的过程，保存更改前后的结果，并备注报告更改原因。
4.5.2.2.3  实验室应严格控制对检测报告的更改，实验室主管或经授权人员应监控报告更改过程。
4.5.2.3  检测报告的重新签发
4.5.2.3.1  完成更改的纸载报告或电子报告，经相关责任人确认无误，实验室主管或经授权人员进行最后的审核签发。
4.5.2.3.2  完成更改的集中化检测报告，经相关责任人确认无误，由实验室主管或经授权人员向检测委托方重新签发。
4.5.3  血液标本的保存和销毁
4.5.3.1  标本保存
4.5.3.1.1  全血标本的保存：全血标本保存形式包括血液检测原始标本管或含有血液的导管。标本需保存于2－8℃冰箱，保存期与全血有效期相同。
4.5.3.1.2  血清（浆）标本的保存
    血清（浆）标本保存形式包括取自于血液导管的血清（浆）标本或取自于血液检测原始标本管的血清（浆）标本。
a)        取自于血液导管的血清（浆）标本。应避免红细胞对标本的污染。标本需保存于-20℃以下冰柜中至全血有效期满后半年。
b)        取自于血液检测原始标本管的血清（浆）标本。应采取恰当的分样方法将其保留到适当的容器中，防止分样过程中标本的交叉污染。标本需保存于-20℃以下冰柜中至全血有效期满后半年。
4.5.3.1.3  用于保存的所有类型的血液标本应清晰标识，确保对标本进行准确、快速的回溯。
4.5.3.2  标本的销毁
4.5.3.2.1  血液检测原始标本管、保存期满的全血标本和血清（浆）标本，按相关规定实施标本销毁。
4.5.3.2.2  标本的销毁应按照《医疗卫生机构医疗废物管理办法》和《医疗废物管理条例》中相关规定进行处理。
4.5.3.2.3  建立标本销毁记录

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附  录  A
（资料性附录）
血液检测方法的确认
A.1        总则
本章节讨论了血站血液检测实验室采用一项新的检测方法，或更换现有检测方法时需要考虑的因素。通常血液检测方法包括完成检测必需的仪器、试剂、校准品、实验程序组合。检测方法必须由实验室选择。必须按照生产商的说明书进行操作，确保检测结果符合实验室的要求。
依据《献血者健康检查要求》：血站对献血者及其捐献的血液进行强制性血液筛查包括输血相关传染病病原学标志物检测（乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体、艾滋病抗体、梅毒螺旋体抗体实验）、血型血清学检测（ABO正反定型及Rh(D)抗原筛查实验）和酶学检测（谷丙转氨酶实验）。方法学包括酶联免疫吸附实验（ELISA法）、凝集法、速率法或赖氏法，以及用于献血者采血前检查的快速诊断实验。
由于以上方法学原理的不同，其检测方法的确认没有统一标准。本规程依据当今国际公认的一些法规和指南，提供了血站血液检测实验室常规使用的血液检测方法确认的原则和步骤，诣在提高血液检测实验室对检测方法确认的一致性和效率，确保检测方法变化的过程得到有效控制。帮助用户满足文件和法规的要求。
A.2         范围
本章节为血站血液检测实验室血液检测方法确认提供方案。实验室需选择国家批准的符合国家要求的仪器、试剂盒或检测方法。在新方法投入常规使用报告检测结果之前，需要就检测方法在实验室的使用性能进行确认。不建议实验室对生产商提供的检测方法进行自行改动，如果确实需要修改，应与生产商合作进行新检测方法性能的评价测试，以确认修改后的系统在实验室的适用性和可靠性。血站血液检测实验室是血液检测方法使用的最终用户。
需确认的对象包括：
实验室首次引入的检测方法，如实验室从未使用过的试剂、仪器等。
实验室首次将某项目引入现用检测方法，如HBsAg项目由A仪器检测改为由B仪器检测。
若多台仪器（相同品牌和型号）检测同一个项目，应对每一台仪器的性能进行确认比较。
A.3         输血相关传染病标志物检测方法的确认
以下内容适用于酶联免疫吸附实验的确认。快速诊断实验和确证实验等定性方法的确认可参照本规程。
A.3.1        确认的一般要求
A.3.1.1         实验操作的培训
开始确认新的检测方法之前，操作人员应当有充分的时间熟悉新系统，确定关键的操作步骤。生产商应提供试剂或仪器的操作说明，实验原理，规格，实验步骤，局限性，质量控制和健康安全信息。生产商应对操作者进行培训，确保操作人员正确操作。
A.3.1.2         试剂的准备
应选择经国家检定合格的病原学标志物诊断试剂。严格遵从生产商的说明书进行操作。对于正在进行确认的试剂，所有组份应来源于同一批试剂，不能由其他试剂所替代或实验室自己配制。
A.3.1.3         仪器的准备
应选择国家批准使用的检测仪器。实验开始前，按要求对仪器进行维护校准。对于开放试剂的仪器设备，特别注意试剂说明书要求的操作条件与仪器性能是否相适应。如果仪器性能与试剂盒说明书的要求有差异，可以征得试剂生产商协助和同意，对本实验室仪器的实验操作参数进行修正，以达到试剂盒要求的实验状态。
A.3.1.4           质量控制
应建立有效的质量控制程序。除直接采用生产商提供的质控品外，还应选择质量、来源稳定，无基质效应的质控品作为另外的室内质控物。如可能，多实验方法比较过程中，应采用相同质控物。一些定性实验每天只需要使用阴性和阳性质控物（如TRUST实验），而另一些定性实验可以产生量化的质控结果。对此可以采用统计过程控制方法（SPC），用量化数据监控实验过程。确认实验采用的标本不能等同于质控品使用。实验过程中，应确保过程处于受控状态，否则必须重新实验。
A.3.1.5         保持记录
应记录和监控操作人员在实验过程中的健康安全，确保符合法律要求。保留检测全过程的数据和结果，包括检测的速度和使用的适宜性等。

A.3.2        重复性实验
A.3.2.1         生产商提供的阴性阳性对照品实验
A.3.2.1.1.        实验程序：采用生产商提供的阴性、阳性对照品，在不低于10天实验运行的前提下，进行至少20次检测。
A.3.2.1.2.        可接受标准：20次检测结果不能出现大于1次阴性阳性对照品不符合生产商要求。否则实验室必须终止实验，咨询试剂生产商，查找原因，采取纠正措施。

A.3.2.2        方法精密性实验
A.3.2.2.1.        实验程序：在定性实验中，如果能够产生量化实验结果（如ELISA实验），应采用接近临界值的标本，对精密度进行估计。建议采用S/CO为cutoff值2～4倍的标本，不适宜采用低值的阴性标本和高值阳性标本，因为此类标本距医学决定水平点，即临界值（cutoff）的分析浓度相距较远。
A.3.2.2.2.        可接受标准：批内变异系数在15%以内，批间变异系数在20%以内。

A.3.2.3        靠近临界值浓度分析物的重复性实验
A.3.2.3.1.        临界值浓度
定性实验临界值浓度是重复检测产生50%阳性结果和50％阴性结果的分析浓度。在此浓度基础上少量增加分析物，可以产生多数阳性，少数阴性的实验结果。在此浓度基础上减少相同的分析物，可以产生相反的结果。对临界值浓度左右一定范围内的标本进行检测，具有较高的不精密性和实验结果的不一致性。
高于临界值浓度，重复实验结果95%为阳性，或者低于临界值浓度，重复实验结果95%为阴性的浓度值，被称为该实验方法临界值的"95%区间值"。从临界值到高低95%区间值内，不同的检测系统重复检测始终产生一致性结果的能力不同，这种差异是比较检测系统性能的有效指标。
A.3.2.3.2.        实验程序
本实验的目的是确定被确认方法的临界值浓度，判断±20%临界值浓度是否落于95%区间值内。本实验不能具体明确95%区间或产生一致性结果的分析物浓度范围，但是能够说明这个范围是否位于或超出±20%临界值浓度界限。该实验是以靠近临界值浓度范围内，量值反应曲线呈线性为基础，否则难以产生有效结果。
A.3.2.3.2.1.        确定临界值浓度：大多数试剂说明书没有提供临界值浓度。可采用阳性血清配制系列稀释标本。重复检测稀释标本，确定产生50%阳性结果和50%阴性结果的稀释度，这个稀释度就是本实验的临界值浓度。如果不能够得到50%阳性结果和50%阴性结果的稀释度，可能的原因是检测数据标本量不足或该方法临界值附近量值反应曲线不呈线性。
A.3.2.3.2.2.        标本准备：准备三份标本，浓度分别为临界值浓度，＋20%临界值浓度，－20%临界值浓度。标本量应满足20次以上的测试。
A.3.2.3.3.        判断±20%临界值浓度是否落于95%区间
A.3.2.3.3.1.        如果＋20%临界值浓度标本产生的阳性结果≥95%，或－20%临界值浓度标本产生的阴性结果≥95%，可以预计±20%临界值浓度的标本能够产生一致性的结果。
A.3.2.3.3.2.        如果＋20%临界值浓度标本产生的阳性结果＜95%，或－20%临界值浓度标本产生的阴性结果＜95%，可以预计±20%临界值浓度的标本不能够产生一致性的结果，本方法95%区间值大于或小于±20%临界值浓度。

A.3.3        灵敏度及特异性实验
本实验采用已知真实血清学状态的标本，经检测获得方法灵敏度和特异性方面的信息。也可以将不同方法的灵敏性和特异性进行比较，得到量化的差异结果，判断是否具有统计学意义。
A.3.3.1        标本的选择
灵敏度和特异性实验通常对已知真实血清学状态的标本进行检测。确定标本真实血清学状态可以采用金标准方法或临床诊断方法。参考血清盘或能力验证（PT）的标本可用于本实验。参考血清盘是指经过检测或经过与公认方法比较，或具有临床诊断意义的标本。这些标本已经确立了真实的血清学状态，可追溯至经典方法或临床诊断结果。可以从权威机构、专业研究机构和文献中获得参考血清盘的来源。参考血清盘应包含具有不同分析物浓度的临床标本。如可能，血清盘应包含对检测具有干扰的标本。如可造成假阴性和假阳性结果的自身免疫性疾病、螺旋体疾病、白细胞抗体、风湿性关节炎、多发性骨髓瘤患者的标本。尽管商品化参考血清盘在方法确认过程中，具有很好的时间和资源效率，但其局限性在于可能忽视了实验室目的检测人群中疾病的流行率和病原学因子抗原谱的分布。因此，使用参考血清盘、能力验证标本结合常规实验室检测标本，可以提供更有意义、更可靠的确认结果。
PT材料可能存在基质干扰，对方法性能产生错误判断。当PT材料为阴性阳性临界标本，或分子结构不同于天然血清，导致抗原决定簇不能被正常识别时，这种干扰尤其明显。
A.3.3.2         标本的数量
标本数量的估算，统计学中称为样本含量的估算依据实验设计的类型、结果变量的性质、研究目的和采用的统计分析方法而不同。对于检测结果为计数资料的实验（如定性实验），一般而言，在实验误差控制较好的情况下，不同血清学状态的标本数量至少为30份。否则可能影响实验的统计学功效。
A.3.3.3         标本的保存
应确保标本可用于常规检测并处于稳定状态，尽可能保持实验标本新鲜。如需冻存，血清或血浆应保存在-20℃的条件下。实验标本的保存状态、冻融次数、使用次数和时间应尽量一致，避免标本产生偏差。如需要方法比较实验，应在相同时间进行，最大限度减小由于标本放置时间不同产生的结果差异。
A.3.3.4         数据的收集和整理
及时记录和检查所有实验数据，尽早发现系统和人为的误差。如果能够确定一些结果是由于可知的差错造成，应详细记录差错原因，数据不能用于后续分析过程。如果不能够确定产生异常结果的原因，在数据组中保留原始结果。
A.3.3.5         数据的分析
A.3.3.5.1.        单一检测方法灵敏性和特异性估计
如果明确了每份检测标本真实的血清学状态，检测方法的灵敏度和特异性很容易计算。表1为反映一个定性实验检测已知真实血清学状态标本的结果的2×2四格表资料。通过这组数据可以计算被估计的灵敏度、特异性。
表1  X方法血液检测结果
        真实诊断结果
方法X        阳性        阴性        总计
阳性        A        B        A+B
阴性        C        D        C+D
总计        A+C        B+D        N
A.3.3.5.1.1.        灵敏度和特异性
估计灵敏度＝100%〔A/(A+C)〕
估计特异性＝100%〔D/(B+D)〕
A.3.3.5.1.2.        灵敏度和特异性95%置信区间
灵敏度和特异性的精确置信限可通过二项分布计算。许多统计软件支持此功能。Altman、Agresti 、Coull推荐了一种能够应用于所有情况的直接计算方法，称为分值置信区间计算法。
[100%(Q1-Q2)/Q3,  100%(Q1+Q2)/Q3]
对于灵敏性
Q1=2A+1.962=2A+3.84
Q2=1.96
Q3=2(A+C+1.962)=2(A+C)+7.68
对于特异性
Q1=2D+1.962=2D+3.84
Q2=1.96
Q3=2(B+D+1.962)=2(B+D)+7.68
上述公式中，1.96是95%置信限下标准正态分布的分位数。
如果用户对估计的灵敏度和特异性可以接受，则不需进行其他数据分析。
A.3.3.5.2.        两方法灵敏度和特异性的比较
可采用完全随机设计和配对设计实验，比较两检测方法的灵敏度和特异性。完全随机设计时，可采用完全随机设计x2检验。两方法采用不同的标本，标本相对独立。这种情况下两方法灵敏度和特异性的比较实际是两样本率的比较。配对设计时，可采用配对设计的McNemar x2检验。两方法采用相同的标本，得到两个相关的灵敏度和特异性，这时注意当标本数较少时，需要计算校正x2或采用精确概率法检验。详细计算见本章节5.3部分。
注意如果需要判断检测方法的准确性，单凭比较灵敏度和特异性是不够的。除非一个方法的灵敏度和特异性均大于或小于另一方法，否则只能比较相同灵敏度时的特异性，或相同特异性时的灵敏度。当灵敏性和特异性均不相同时，很难比较两方法准确性。这时可采用受试者工作特征曲线法（ROC曲线法）进行比较。该法是近年来公认的评价和比较检测方法准确度的较好方式。该方法可以考虑检测方法在所有临界值时的灵敏度和特异性。通过比较不同方法ROC曲线下的面积，确定和比较方法的特性。鉴于此项内容不在本规程要求的范围，实验室人员如需要了解更多信息，可以查找相关资料。
如果需要量化两方法灵敏度和特异性之间差异，可以对灵敏度或特异性的差异进行估计。以配对设计实验为例，两方法采用相同的标本进行检测的结果可以汇集成表2。如果两方法采用的标本不同，则不能采用表2的方式整理数据。
表2 两方法检测结果和临床诊断结果的三项比较
方法结果        总标本数        真实诊断
方法1        方法2                阳性        阴性
阳性        阳性        a=a1+a2        a1        a2
阳性        阴性        b=b1+b2        b1        b2
阴性        阳性        c=c1+c2        c1        c2
阴性        阴性        d=d1+d2        d1        d2
总标本数                N        n1        n2

A.3.3.5.2.1.        两方法灵敏度差异估计
两方法灵敏度估计
灵敏度1＝
灵敏度2＝

两方法灵敏度差异估计
灵敏度1－灵敏度2＝

灵敏度差异95%的置信区间
D=灵敏度1－灵敏度2

因子计算
l1＝方法1灵敏度95%置信区间的低限
u1＝方法1灵敏度95%置信区间的高限

l2＝方法2灵敏度95%置信区间的低限
u2＝方法2灵敏度95%置信区间的高限
     （如果 1＝0， 4＝0，直接计算 5）

如果 ＞ ，   
如果0≤ ≤0，
如果 ＜0， ＝
    (如果  )



A.3.3.5.2.2.        两方法特异性差异估计
两方法特异性估计
特异性1＝
特异性2＝

两方法特异性差异估计
特异性1－特异性2＝

特异性差异95%的置信区间
D=特异性1－特异性2

因子计算
l1＝方法1特异性95%置信区间的低限
u1＝方法1特异性95%置信区间的高限

l2＝方法2特异性95%置信区间的低限
u2＝方法2特异性95%置信区间的高限
（如果 1＝0， 4＝0，直接计算 5）

如果 ＞ ，   
如果0≤ ≤0，
如果 ＜0， ＝
    (如果  )



A.3.3.5.3.        不同检测方法检测结果的统计分析
通常采用配对设计四格表x2检验和Kappa检验评价两个定性检测方法性能的差异或一致性。
如果已知标本的血清学状态，或者已存在特设或隐含的金标准结果，可采用配对设计四格表x2检验中的McNemar x2检验评价两方法结果的不一致性，Kappa检验评价两方法结果的一致性。
如果未知标本的血清学状态，检测结果有序变量的档次划分也是相同的，也可以采用Kappa检验评价两种检测方法结果的一致性。另外，两方法的符合性指标也能够量化两种检测方法结果的一致程度。
A.3.3.5.3.1.        配对设计四格表x2检验（McNemar x2检验）：对于隐含金标准或特设金标准的2×2四格表资料，可采用McNemar x2检验，判断两种检测方法结果不一致部分是否具有统计学意义。该法适用于样本含量适中的资料，因为本法仅仅考虑两检测方法不一致的情况，而未考虑两方法检测结果一致的情况。当n很大，两方法一致率较高，不一致结果数量较小，即使McNemar x2检验具有统计学意义，但实际意往往不大。通常适用于b+c≥40。
     
   注意当25≤b＋c＜40，采用McNemar检验分析配对设计四格表资料需作连续性校正。

若b+c＜25，应采用精确概率法检验。
A.3.3.5.3.2.        Kappa检验：Kappa统计量是Cohen1960年提出的一种校正机遇之后衡量两种检测方法一致性的指标。Kappa（常缩写成K）值在－1到＋1之间，如果K＝－1，说明两种检测方法检测的结果完全不一致；K＝0，说明观察的一致性完全由偶然误差造成；K＝1，说明完全排除机遇一致性后的真正一致性。一般对总体而言，若K＞0.75，表明一致性为优；若K在0.4～0.75之间，表明一致性良好；若K＜0.4，表明一致性较差。





A.3.3.5.3.3.        两种检测方法结果的符合性估计
如果需要量化两方法检测结果的符合程度，可以对两方法检测结果的符合性进行估计。
        方法2       
方法1        阳性        阴性        总计
阳性        a        b        a+b
阴性        c        d        c+d
总计        a+c        b+d       
符合性＝100%[(a+d)/n]
符合性95%的置信区间
[100%(Q1-Q2)/Q3,  100%(Q1+Q2)/Q3]
Q1=2(a+d)+1.962=2(a+d)+3.84
Q2=1.96
Q3=2(n+1.962)=2n+7.68

A.4         ALT检测方法的确认
以下内容适用于ALT速率法和赖氏法确认。其它定量检测方法确认可参照本规程。
A.4.1        确认的一般要求
A.4.1.1         实验操作的培训
开始确认新的检测方法之前，操作人员应当有充分的时间熟悉新系统，确定关键的操作步骤。生产商应提供试剂或仪器的操作说明，实验原理，规格，实验步骤，局限性，质量控制和健康安全信息。生产商应对操作者进行培训，确保操作人员正确操作被确认系统。
A.4.1.2        试剂的准备
应选择国家批准生产的ALT诊断试剂。严格遵从生产商的说明书进行操作。对于正在进行确认的试剂，所有组份应来源于同一批试剂，不能由其他试剂所替代或实验室自己配制。
A.4.1.3        仪器的准备
应选择国家批准使用的检测仪器。实验开始前，按照要求对仪器进行校准。校准品必须能够溯源至国家或国际标准。可以由校准品的生产商提供相关的校准程序和溯源证明。对于开放试剂的仪器设备，特别注意试剂说明书要求的操作条件与仪器性能是否相适应。如果仪器性能与试剂盒说明书的要求有差异，可以征得试剂生产商协助和同意，对本实验室仪器的实验操作参数进行修正，以达到试剂盒要求的实验状态。
A.4.1.4        质量控制
应建立有效的质量控制程序。选择质量、来源稳定，无基质效应的质控品作为室内质控物。确认实验采用的标本不能等同于质控品使用。应确保实验过程处于受控状态，否则必须重新实验。
A.4.1.5        保持实验记录
应记录和监控操作人员在实验过程中的健康安全，确保符合法律要求。保留检测全过程的数据和结果，包括检测的速度和使用的适宜性等。
A.4.2        正确度的估计
A.4.2.1        正确度估计最常用的方法
A.4.2.1.1.        方法比较实验：采用新的检测方法和参加过能力验证的检测方法或公认的参考方法，同时检测一批不同ALT浓度的标本。通过结果的差异了解新系统引入后的偏倚是否在允许误差范围内。通常将新系统方法称为实验方法，与之比较的系统方法称为比较方法，该实验也称为方法学比较实验。
A.4.2.1.2.        能力验证活动：直接参加权威机构组织的能力验证活动，能力验证的成绩可以证明新的检测方法检测结果的准确性。
A.4.2.2        方法比较实验
A.4.2.2.1.        标本的选择
A.4.2.2.1.1.        标本数量：实验标本数至少40份，更多的标本量可以使实验结果更加可靠。每份标本应有足以完成双份测定的量。如果不够，可以将分析物浓度接近的两份标本混合使用。
A.4.2.2.1.2.        标本分析物浓度范围：如可能，应选择有50％实验标本的分析物浓度不在参考范围内。
A.4.2.2.2.        实验程序
时间至少5天。采用两种方法，将标本按照序号递增和递减的顺序测定2次。如第1次检测序号为1、2、3、4、5、6、7、8，第2次为8、7、6、5、4、3、2、1。当天的方法比较实验应在2小时内完成。
A.4.2.2.3.        数据分析
A.4.2.2.3.1.        初步判断：剔除有明显人为误差的结果。内部质控失控时，必须重新检测。
A.4.2.2.3.2.        离群点的剔除：设比较方法测定结果为x值，第一次测定值为x1，第二次测定值为x2。。实验方法测定结果为y值，第一次测定值为y1，第二次测定值为y2。。
A.4.2.2.3.3.        方法内重复测定值离群点的去除
计算△xi=∣xi1-xi2∣; △yi=∣yi1-yi2∣
计算 ；
计算4 ，4
以4 和4 为离群限值，如果没有超出，继续方法间配对结果离群点检验；否则继续相对差异检验，进行如下最终判断
计算 ；
计算 ；
最终以4 和4 为判断离群点限值
A.4.2.2.3.4.        方法间配对结果离群点的去除
计算Eij＝∣yij-xij∣,i为标本序号1～40，j为重复结果序号1或2。
计算
以4 为离群限值。如果全部实验数据中离群点超过2个，应补充实验数据。
A.4.2.2.3.5.        初步判断线性回归状况
x－y散点图
以比较方法所有结果为x值，实验方法所有结果为y值，绘制散点图。
以比较方法每个标本两次检测结果的均值为x值，实验方法每个标本两次检测结果的均值为y值，绘制散点图。比较两图有无明显差异。如无明显差异，说明方法比较实验的随机误差对比较结果影响不大。
x均值（x－y）均值差散点图
以比较方法每个标本两次检测的均值为x值，两方法实验结果均值差（x－y）为y值，绘制散点图。观察均值差随x值增大的变化。如果点的分布表现出一定的趋势，预示着两方法之间系统误差的存在。
A.4.2.2.3.6.        标本分析物浓度分布检验
实验点的离散度和对应分析物浓度分布的宽度都会影响r值的大小。一般如果r≥0.975（r2≥0.95），x取值范围适宜，否则应扩大数据范围。
A.4.2.2.3.7.        线性回归计算
每份标本用两个方法进行两次测定。将比较方法的x1和实验方法的y1对应，比较方法的x2和实验方法的y2对应，组成成对数据。采用所有成对数据进行直线回归。得回归方程 。理想状态下 ，即b＝1， ＝0。如果b≠1， ≠0，说明两方法间存在系统误差，需要对误差进行评估。如了解Y方法引入后相对于X方法在临床决定水平浓度xc处的系统误差（SE）。

A.4.2.2.4.        可接受标准
A.4.2.2.4.1.        r≥0.975或r2≥0.95
A.4.2.2.4.2.        医学决定水平xc处新方法引入的系统误差小于CLIA'88允许误差的1/2。

A.4.3        精密度的估计
精密度估计最常用的方法是采用稳定的标本进行重复检测。求得均值（x）、标准差(s)和变异系数（CV）。精密度的好坏通常采用不精密度表示，不精密度通常以CV体现。应在明确标本的来源、浓度、实验周期的前提下，确定检测方法的不精密度。
A.4.3.1        标本的选择
A.4.3.1.1.        标本分析物浓度范围：鉴于血站血液检测实验室检测对象为健康的献血人群，可采用中、低两个ALT浓度的标本进行精密度实验。标本的基质应近似于人源标本。
A.4.3.1.2.        标本的保存：精密度实验需要在若干天内完成，对于冰冻保存的标本和冻干复溶标本，应严格控制操作手法均一、复溶时间、加液的准确性、混匀的力度等，力求实验标本的稳定、均一。
A.4.3.2        实验程序
A.4.3.2.1.        对每个水平的标本分别做批内和天间的重复测定。精密度实验与常规标本检测同时进行，不可替代实验的质量控制过程。
A.4.3.2.2.        批内实验：将实验标本插入常规检测标本一同检测。一批内连做20次。对应质控结果为受控状态。
A.4.3.2.3.        批间实验：每天对实验标本做1次检测，连做20天。每天对应质控结果为受控状态。
A.4.3.3        数据分析
A.4.3.3.1.        标准差计算
批内和天间标准差均可采用以下公式计算

A.4.3.3.2.        变异系数计算
批内和天间变异系数均可采用以下公式计算
×100
A.4.3.4        可接受标准
参照Westgard和Ceroblewski等提出高效检验对精密度要求的观点，批内不精密度CV应小于CLIA允许误差的1/4，批间不精密度CV应小于CLIA允许误差的1/3。对于ALT实验，CLIA允许误差限值T±20%，因此ALT检测方法的批内不精密度CV应小于5%，批间不精密度CV应小于6.7%。

A.4.4        检测可报告范围
检测可报告范围确认实验通常采用配制包含不同分析物浓度的系列标本进行检测，将按稀释比例计算的预期值和实际测量值设置为两个变量进行线性回归。回归直线应当为过原点，斜率为1的直线。直线所达的限值即为结果的检测范围。
A.4.4.1        标本的选择
准备一份ALT<30IU的低浓度血清（L）和ALT在500IU左右的高浓度血清（H）。将高低两份血清按照5L, 4L+1H, 3L+2H, 2L+3H, 1L+4H, 5H的比例配制混合，形成系列血清。
A.4.4.2        实验程序
检测系列血清，每份标本重复4次。
A.4.4.3        数据分析
A.4.4.3.1.        剔除异常点：剔除明显异常的检测结果，并补充数据。
A.4.4.3.2.        计算预期值：计算低值和高值标本的结果均值。按照稀释关系，计算每个标本的分析物理论浓度，即为预期值。
A.4.4.3.3.        预期值－实测值的线性回归：每个标本有4个重复实验的实测值。每个实测值与其预期值相对应，形成成对数据。以x表示预期值，y表示实测值，描点绘图。得到回归方程 。
A.4.4.3.4.        初步判断：理想状态下 中b＝1， ＝0。但实际工作中很难达到。因此如果b在1.00±0.03的范围内， 近于0，则可直接判断该方法可报告范围在实验涉及浓度范围内。
A.4.4.3.5.        如果b不接近1， 较大，应具体分析高浓度还是低浓度的预期值和实测值存在较大偏倚。可以舍去某组数据，重新进行回归计算。如果缩小范围后，b和 能够满足要求，即说明缩小的浓度范围即是实际的检测范围。
A.4.4.3.6.        可以通过以下统计假设检验进行判断。
A.4.4.3.6.1.        截距a和0差异的t检验
假设H0：a=0；H1: a≠0；
计算
计算
计算 ，

A.4.4.3.6.2.        斜率b和1差异的t检验
假设H0：b=1；H1: b≠1；
计算
计算
计算 ，

A.4.5        正常值参考范围确认
采用新方法对20份健康献血者血液标本进行检测。最多允许1个结果不在试剂盒提供的参考范围内。

A.5         ABO血型和Rh(D)抗原检测方法的确认
以下内容适用于献血者血型血清学方法确认。
A.5.1        确认的一般要求
A.5.1.1        实验操作的培训
开始确认新的检测方法之前，操作人员应当有充分的时间熟悉新系统，确定关键的操作步骤。生产商应提供试剂或仪器的操作说明，实验原理，规格，实验步骤，局限性，质量控制和健康安全信息。生产商应对操作者进行培训，确保操作人员正确操作。
A.5.1.2        试剂的准备
应选择国家批准使用的血型试剂，严格遵从生产商的说明书进行操作。对于正在进行确认的试剂，所有组份应来源于同一批试剂，不能由其他试剂所替代（即使另一种试剂为同一厂家生产）或实验室自己配制。实验室对试剂自行修改，如稀释试剂，应取得生产商的认可，因为任何修改可以导致对试剂的质量保证失效，并产生相关责任。
A.5.1.3         仪器的准备
应选择国家批准使用的检测仪器。实验开始前，按照要求对仪器进行维护校准。对于开放试剂的仪器设备，特别注意试剂说明书要求的操作条件与仪器性能是否相适应。如果仪器性能与试剂盒说明书的要求有差异，可以征得试剂生产商协助和同意，对本实验室仪器的实验操作参数进行修正，以达到试剂盒要求的实验状态。
A.5.1.4         质量控制
应建立有效的质量控制程序。确保常规平行实验中已知抗原和已知抗体的质控物反应正确，否则必须重新实验。
A.5.1.5         保持实验记录
应记录和监控操作人员在实验过程中的健康安全，确保符合法律要求。保留检测全过程的数据和结果，包括检测的速度和使用的适宜性等。
A.5.2        平行确认实验
所有实验室应采用平行实验的方式，用常规标本，将新方法与现用方法进行比较，确认新方法的常规使用状态。实验时间最短1周。操作程序和实验结果应文件化。应定期进行关键标本（弱抗原或弱抗体标本）重复实验，确认方法的稳定性和耐用性。

A.6         确认记录
A.6.1        实验过程记录应包括
A.6.1.1        检测标本类型及各类型数量；
A.6.1.2        检测日期；
A.6.1.3        操作实验者的级别和能力；
A.6.1.4        使用试剂的详细资料，包括：批号、效期等；
A.6.1.5        采用修正条件的详细资料，如温度、孵育时间，离心力、加速减速率、离心时间；
A.6.1.6        设备详细资料；
A.6.1.7        判读方法的详细资料，包括适当的cutoff值。
A.6.2        实验结果记录应包括
A.6.2.1        所有结果并绘制表格，包括阳性反应和阴性控制结果；
A.6.2.2        差异结果、数量和类型，以表格形式体现。
A.6.3        确认结论记录应包括
A.6.3.1        用户界面友好性；
A.6.3.2        操作人员需要的水平，培训要求；
A.6.3.3        新产品/系统的实用性、耐用性，自动化效能；
A.6.3.4        不同情况下使用的适宜性（批量标本处理或单一紧急标本处理）；
A.6.3.5        新产品/系统的贮存期，包括贮存末期的性能；
A.6.3.6        方便的仪器维护；
A.6.3.7        健康安全方面，包括数据采集和处理安全性；
A.6.3.8        任何过程中暴露的系统弱点和对系统改进的建议，并通知生产商，如果生产商对此实施了改进方案，重新实验的结果应在报告中体现。

秋天de小志

附  录  A
（资料性附录）
血液检测方法的确认
A.1        总则
本章节讨论了血站血液检测实验室采用一项新的检测方法，或更换现有检测方法时需要考虑的因素。通常血液检测方法包括完成检测必需的仪器、试剂、校准品、实验程序组合。检测方法必须由实验室选择。必须按照生产商的说明书进行操作，确保检测结果符合实验室的要求。
依据《献血者健康检查要求》：血站对献血者及其捐献的血液进行强制性血液筛查包括输血相关传染病病原学标志物检测（乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体、艾滋病抗体、梅毒螺旋体抗体实验）、血型血清学检测（ABO正反定型及Rh(D)抗原筛查实验）和酶学检测（谷丙转氨酶实验）。方法学包括酶联免疫吸附实验（ELISA法）、凝集法、速率法或赖氏法，以及用于献血者采血前检查的快速诊断实验。
由于以上方法学原理的不同，其检测方法的确认没有统一标准。本规程依据当今国际公认的一些法规和指南，提供了血站血液检测实验室常规使用的血液检测方法确认的原则和步骤，诣在提高血液检测实验室对检测方法确认的一致性和效率，确保检测方法变化的过程得到有效控制。帮助用户满足文件和法规的要求。
A.2         范围
本章节为血站血液检测实验室血液检测方法确认提供方案。实验室需选择国家批准的符合国家要求的仪器、试剂盒或检测方法。在新方法投入常规使用报告检测结果之前，需要就检测方法在实验室的使用性能进行确认。不建议实验室对生产商提供的检测方法进行自行改动，如果确实需要修改，应与生产商合作进行新检测方法性能的评价测试，以确认修改后的系统在实验室的适用性和可靠性。血站血液检测实验室是血液检测方法使用的最终用户。
需确认的对象包括：
实验室首次引入的检测方法，如实验室从未使用过的试剂、仪器等。
实验室首次将某项目引入现用检测方法，如HBsAg项目由A仪器检测改为由B仪器检测。
若多台仪器（相同品牌和型号）检测同一个项目，应对每一台仪器的性能进行确认比较。
A.3         输血相关传染病标志物检测方法的确认
以下内容适用于酶联免疫吸附实验的确认。快速诊断实验和确证实验等定性方法的确认可参照本规程。
A.3.1        确认的一般要求
A.3.1.1         实验操作的培训
开始确认新的检测方法之前，操作人员应当有充分的时间熟悉新系统，确定关键的操作步骤。生产商应提供试剂或仪器的操作说明，实验原理，规格，实验步骤，局限性，质量控制和健康安全信息。生产商应对操作者进行培训，确保操作人员正确操作。
A.3.1.2         试剂的准备
应选择经国家检定合格的病原学标志物诊断试剂。严格遵从生产商的说明书进行操作。对于正在进行确认的试剂，所有组份应来源于同一批试剂，不能由其他试剂所替代或实验室自己配制。
A.3.1.3         仪器的准备
应选择国家批准使用的检测仪器。实验开始前，按要求对仪器进行维护校准。对于开放试剂的仪器设备，特别注意试剂说明书要求的操作条件与仪器性能是否相适应。如果仪器性能与试剂盒说明书的要求有差异，可以征得试剂生产商协助和同意，对本实验室仪器的实验操作参数进行修正，以达到试剂盒要求的实验状态。
A.3.1.4           质量控制
应建立有效的质量控制程序。除直接采用生产商提供的质控品外，还应选择质量、来源稳定，无基质效应的质控品作为另外的室内质控物。如可能，多实验方法比较过程中，应采用相同质控物。一些定性实验每天只需要使用阴性和阳性质控物（如TRUST实验），而另一些定性实验可以产生量化的质控结果。对此可以采用统计过程控制方法（SPC），用量化数据监控实验过程。确认实验采用的标本不能等同于质控品使用。实验过程中，应确保过程处于受控状态，否则必须重新实验。
A.3.1.5         保持记录
应记录和监控操作人员在实验过程中的健康安全，确保符合法律要求。保留检测全过程的数据和结果，包括检测的速度和使用的适宜性等。

A.3.2        重复性实验
A.3.2.1         生产商提供的阴性阳性对照品实验
A.3.2.1.1.        实验程序：采用生产商提供的阴性、阳性对照品，在不低于10天实验运行的前提下，进行至少20次检测。
A.3.2.1.2.        可接受标准：20次检测结果不能出现大于1次阴性阳性对照品不符合生产商要求。否则实验室必须终止实验，咨询试剂生产商，查找原因，采取纠正措施。

A.3.2.2        方法精密性实验
A.3.2.2.1.        实验程序：在定性实验中，如果能够产生量化实验结果（如ELISA实验），应采用接近临界值的标本，对精密度进行估计。建议采用S/CO为cutoff值2～4倍的标本，不适宜采用低值的阴性标本和高值阳性标本，因为此类标本距医学决定水平点，即临界值（cutoff）的分析浓度相距较远。
A.3.2.2.2.        可接受标准：批内变异系数在15%以内，批间变异系数在20%以内。

A.3.2.3        靠近临界值浓度分析物的重复性实验
A.3.2.3.1.        临界值浓度
定性实验临界值浓度是重复检测产生50%阳性结果和50％阴性结果的分析浓度。在此浓度基础上少量增加分析物，可以产生多数阳性，少数阴性的实验结果。在此浓度基础上减少相同的分析物，可以产生相反的结果。对临界值浓度左右一定范围内的标本进行检测，具有较高的不精密性和实验结果的不一致性。
高于临界值浓度，重复实验结果95%为阳性，或者低于临界值浓度，重复实验结果95%为阴性的浓度值，被称为该实验方法临界值的"95%区间值"。从临界值到高低95%区间值内，不同的检测系统重复检测始终产生一致性结果的能力不同，这种差异是比较检测系统性能的有效指标。
A.3.2.3.2.        实验程序
本实验的目的是确定被确认方法的临界值浓度，判断±20%临界值浓度是否落于95%区间值内。本实验不能具体明确95%区间或产生一致性结果的分析物浓度范围，但是能够说明这个范围是否位于或超出±20%临界值浓度界限。该实验是以靠近临界值浓度范围内，量值反应曲线呈线性为基础，否则难以产生有效结果。
A.3.2.3.2.1.        确定临界值浓度：大多数试剂说明书没有提供临界值浓度。可采用阳性血清配制系列稀释标本。重复检测稀释标本，确定产生50%阳性结果和50%阴性结果的稀释度，这个稀释度就是本实验的临界值浓度。如果不能够得到50%阳性结果和50%阴性结果的稀释度，可能的原因是检测数据标本量不足或该方法临界值附近量值反应曲线不呈线性。
A.3.2.3.2.2.        标本准备：准备三份标本，浓度分别为临界值浓度，＋20%临界值浓度，－20%临界值浓度。标本量应满足20次以上的测试。
A.3.2.3.3.        判断±20%临界值浓度是否落于95%区间
A.3.2.3.3.1.        如果＋20%临界值浓度标本产生的阳性结果≥95%，或－20%临界值浓度标本产生的阴性结果≥95%，可以预计±20%临界值浓度的标本能够产生一致性的结果。
A.3.2.3.3.2.        如果＋20%临界值浓度标本产生的阳性结果＜95%，或－20%临界值浓度标本产生的阴性结果＜95%，可以预计±20%临界值浓度的标本不能够产生一致性的结果，本方法95%区间值大于或小于±20%临界值浓度。

A.3.3        灵敏度及特异性实验
本实验采用已知真实血清学状态的标本，经检测获得方法灵敏度和特异性方面的信息。也可以将不同方法的灵敏性和特异性进行比较，得到量化的差异结果，判断是否具有统计学意义。
A.3.3.1        标本的选择
灵敏度和特异性实验通常对已知真实血清学状态的标本进行检测。确定标本真实血清学状态可以采用金标准方法或临床诊断方法。参考血清盘或能力验证（PT）的标本可用于本实验。参考血清盘是指经过检测或经过与公认方法比较，或具有临床诊断意义的标本。这些标本已经确立了真实的血清学状态，可追溯至经典方法或临床诊断结果。可以从权威机构、专业研究机构和文献中获得参考血清盘的来源。参考血清盘应包含具有不同分析物浓度的临床标本。如可能，血清盘应包含对检测具有干扰的标本。如可造成假阴性和假阳性结果的自身免疫性疾病、螺旋体疾病、白细胞抗体、风湿性关节炎、多发性骨髓瘤患者的标本。尽管商品化参考血清盘在方法确认过程中，具有很好的时间和资源效率，但其局限性在于可能忽视了实验室目的检测人群中疾病的流行率和病原学因子抗原谱的分布。因此，使用参考血清盘、能力验证标本结合常规实验室检测标本，可以提供更有意义、更可靠的确认结果。
PT材料可能存在基质干扰，对方法性能产生错误判断。当PT材料为阴性阳性临界标本，或分子结构不同于天然血清，导致抗原决定簇不能被正常识别时，这种干扰尤其明显。
A.3.3.2         标本的数量
标本数量的估算，统计学中称为样本含量的估算依据实验设计的类型、结果变量的性质、研究目的和采用的统计分析方法而不同。对于检测结果为计数资料的实验（如定性实验），一般而言，在实验误差控制较好的情况下，不同血清学状态的标本数量至少为30份。否则可能影响实验的统计学功效。
A.3.3.3         标本的保存
应确保标本可用于常规检测并处于稳定状态，尽可能保持实验标本新鲜。如需冻存，血清或血浆应保存在-20℃的条件下。实验标本的保存状态、冻融次数、使用次数和时间应尽量一致，避免标本产生偏差。如需要方法比较实验，应在相同时间进行，最大限度减小由于标本放置时间不同产生的结果差异。
A.3.3.4         数据的收集和整理
及时记录和检查所有实验数据，尽早发现系统和人为的误差。如果能够确定一些结果是由于可知的差错造成，应详细记录差错原因，数据不能用于后续分析过程。如果不能够确定产生异常结果的原因，在数据组中保留原始结果。
A.3.3.5         数据的分析
A.3.3.5.1.        单一检测方法灵敏性和特异性估计
如果明确了每份检测标本真实的血清学状态，检测方法的灵敏度和特异性很容易计算。表1为反映一个定性实验检测已知真实血清学状态标本的结果的2×2四格表资料。通过这组数据可以计算被估计的灵敏度、特异性。
表1  X方法血液检测结果
        真实诊断结果
方法X        阳性        阴性        总计
阳性        A        B        A+B
阴性        C        D        C+D
总计        A+C        B+D        N
A.3.3.5.1.1.        灵敏度和特异性
估计灵敏度＝100%〔A/(A+C)〕
估计特异性＝100%〔D/(B+D)〕
A.3.3.5.1.2.        灵敏度和特异性95%置信区间
灵敏度和特异性的精确置信限可通过二项分布计算。许多统计软件支持此功能。Altman、Agresti 、Coull推荐了一种能够应用于所有情况的直接计算方法，称为分值置信区间计算法。
[100%(Q1-Q2)/Q3,  100%(Q1+Q2)/Q3]
对于灵敏性
Q1=2A+1.962=2A+3.84
Q2=1.96
Q3=2(A+C+1.962)=2(A+C)+7.68
对于特异性
Q1=2D+1.962=2D+3.84
Q2=1.96
Q3=2(B+D+1.962)=2(B+D)+7.68
上述公式中，1.96是95%置信限下标准正态分布的分位数。
如果用户对估计的灵敏度和特异性可以接受，则不需进行其他数据分析。
A.3.3.5.2.        两方法灵敏度和特异性的比较
可采用完全随机设计和配对设计实验，比较两检测方法的灵敏度和特异性。完全随机设计时，可采用完全随机设计x2检验。两方法采用不同的标本，标本相对独立。这种情况下两方法灵敏度和特异性的比较实际是两样本率的比较。配对设计时，可采用配对设计的McNemar x2检验。两方法采用相同的标本，得到两个相关的灵敏度和特异性，这时注意当标本数较少时，需要计算校正x2或采用精确概率法检验。详细计算见本章节5.3部分。
注意如果需要判断检测方法的准确性，单凭比较灵敏度和特异性是不够的。除非一个方法的灵敏度和特异性均大于或小于另一方法，否则只能比较相同灵敏度时的特异性，或相同特异性时的灵敏度。当灵敏性和特异性均不相同时，很难比较两方法准确性。这时可采用受试者工作特征曲线法（ROC曲线法）进行比较。该法是近年来公认的评价和比较检测方法准确度的较好方式。该方法可以考虑检测方法在所有临界值时的灵敏度和特异性。通过比较不同方法ROC曲线下的面积，确定和比较方法的特性。鉴于此项内容不在本规程要求的范围，实验室人员如需要了解更多信息，可以查找相关资料。
如果需要量化两方法灵敏度和特异性之间差异，可以对灵敏度或特异性的差异进行估计。以配对设计实验为例，两方法采用相同的标本进行检测的结果可以汇集成表2。如果两方法采用的标本不同，则不能采用表2的方式整理数据。
表2 两方法检测结果和临床诊断结果的三项比较
方法结果        总标本数        真实诊断
方法1        方法2                阳性        阴性
阳性        阳性        a=a1+a2        a1        a2
阳性        阴性        b=b1+b2        b1        b2
阴性        阳性        c=c1+c2        c1        c2
阴性        阴性        d=d1+d2        d1        d2
总标本数                N        n1        n2

A.3.3.5.2.1.        两方法灵敏度差异估计
两方法灵敏度估计
灵敏度1＝
灵敏度2＝

两方法灵敏度差异估计
灵敏度1－灵敏度2＝

灵敏度差异95%的置信区间
D=灵敏度1－灵敏度2

因子计算
l1＝方法1灵敏度95%置信区间的低限
u1＝方法1灵敏度95%置信区间的高限

l2＝方法2灵敏度95%置信区间的低限
u2＝方法2灵敏度95%置信区间的高限
     （如果 1＝0， 4＝0，直接计算 5）

如果 ＞ ，   
如果0≤ ≤0，
如果 ＜0， ＝
    (如果  )



A.3.3.5.2.2.        两方法特异性差异估计
两方法特异性估计
特异性1＝
特异性2＝

两方法特异性差异估计
特异性1－特异性2＝

特异性差异95%的置信区间
D=特异性1－特异性2

因子计算
l1＝方法1特异性95%置信区间的低限
u1＝方法1特异性95%置信区间的高限

l2＝方法2特异性95%置信区间的低限
u2＝方法2特异性95%置信区间的高限
（如果 1＝0， 4＝0，直接计算 5）

如果 ＞ ，   
如果0≤ ≤0，
如果 ＜0， ＝
    (如果  )

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A.3.3.5.3.        不同检测方法检测结果的统计分析
通常采用配对设计四格表x2检验和Kappa检验评价两个定性检测方法性能的差异或一致性。
如果已知标本的血清学状态，或者已存在特设或隐含的金标准结果，可采用配对设计四格表x2检验中的McNemar x2检验评价两方法结果的不一致性，Kappa检验评价两方法结果的一致性。
如果未知标本的血清学状态，检测结果有序变量的档次划分也是相同的，也可以采用Kappa检验评价两种检测方法结果的一致性。另外，两方法的符合性指标也能够量化两种检测方法结果的一致程度。
A.3.3.5.3.1.        配对设计四格表x2检验（McNemar x2检验）：对于隐含金标准或特设金标准的2×2四格表资料，可采用McNemar x2检验，判断两种检测方法结果不一致部分是否具有统计学意义。该法适用于样本含量适中的资料，因为本法仅仅考虑两检测方法不一致的情况，而未考虑两方法检测结果一致的情况。当n很大，两方法一致率较高，不一致结果数量较小，即使McNemar x2检验具有统计学意义，但实际意往往不大。通常适用于b+c≥40。
     
   注意当25≤b＋c＜40，采用McNemar检验分析配对设计四格表资料需作连续性校正。

若b+c＜25，应采用精确概率法检验。
A.3.3.5.3.2.        Kappa检验：Kappa统计量是Cohen1960年提出的一种校正机遇之后衡量两种检测方法一致性的指标。Kappa（常缩写成K）值在－1到＋1之间，如果K＝－1，说明两种检测方法检测的结果完全不一致；K＝0，说明观察的一致性完全由偶然误差造成；K＝1，说明完全排除机遇一致性后的真正一致性。一般对总体而言，若K＞0.75，表明一致性为优；若K在0.4～0.75之间，表明一致性良好；若K＜0.4，表明一致性较差。





A.3.3.5.3.3.        两种检测方法结果的符合性估计
如果需要量化两方法检测结果的符合程度，可以对两方法检测结果的符合性进行估计。
        方法2       
方法1        阳性        阴性        总计
阳性        a        b        a+b
阴性        c        d        c+d
总计        a+c        b+d       
符合性＝100%[(a+d)/n]
符合性95%的置信区间
[100%(Q1-Q2)/Q3,  100%(Q1+Q2)/Q3]
Q1=2(a+d)+1.962=2(a+d)+3.84
Q2=1.96
Q3=2(n+1.962)=2n+7.68

A.4         ALT检测方法的确认
以下内容适用于ALT速率法和赖氏法确认。其它定量检测方法确认可参照本规程。
A.4.1        确认的一般要求
A.4.1.1         实验操作的培训
开始确认新的检测方法之前，操作人员应当有充分的时间熟悉新系统，确定关键的操作步骤。生产商应提供试剂或仪器的操作说明，实验原理，规格，实验步骤，局限性，质量控制和健康安全信息。生产商应对操作者进行培训，确保操作人员正确操作被确认系统。
A.4.1.2        试剂的准备
应选择国家批准生产的ALT诊断试剂。严格遵从生产商的说明书进行操作。对于正在进行确认的试剂，所有组份应来源于同一批试剂，不能由其他试剂所替代或实验室自己配制。
A.4.1.3        仪器的准备
应选择国家批准使用的检测仪器。实验开始前，按照要求对仪器进行校准。校准品必须能够溯源至国家或国际标准。可以由校准品的生产商提供相关的校准程序和溯源证明。对于开放试剂的仪器设备，特别注意试剂说明书要求的操作条件与仪器性能是否相适应。如果仪器性能与试剂盒说明书的要求有差异，可以征得试剂生产商协助和同意，对本实验室仪器的实验操作参数进行修正，以达到试剂盒要求的实验状态。
A.4.1.4        质量控制
应建立有效的质量控制程序。选择质量、来源稳定，无基质效应的质控品作为室内质控物。确认实验采用的标本不能等同于质控品使用。应确保实验过程处于受控状态，否则必须重新实验。
A.4.1.5        保持实验记录
应记录和监控操作人员在实验过程中的健康安全，确保符合法律要求。保留检测全过程的数据和结果，包括检测的速度和使用的适宜性等。
A.4.2        正确度的估计
A.4.2.1        正确度估计最常用的方法
A.4.2.1.1.        方法比较实验：采用新的检测方法和参加过能力验证的检测方法或公认的参考方法，同时检测一批不同ALT浓度的标本。通过结果的差异了解新系统引入后的偏倚是否在允许误差范围内。通常将新系统方法称为实验方法，与之比较的系统方法称为比较方法，该实验也称为方法学比较实验。
A.4.2.1.2.        能力验证活动：直接参加权威机构组织的能力验证活动，能力验证的成绩可以证明新的检测方法检测结果的准确性。
A.4.2.2        方法比较实验
A.4.2.2.1.        标本的选择
A.4.2.2.1.1.        标本数量：实验标本数至少40份，更多的标本量可以使实验结果更加可靠。每份标本应有足以完成双份测定的量。如果不够，可以将分析物浓度接近的两份标本混合使用。
A.4.2.2.1.2.        标本分析物浓度范围：如可能，应选择有50％实验标本的分析物浓度不在参考范围内。
A.4.2.2.2.        实验程序
时间至少5天。采用两种方法，将标本按照序号递增和递减的顺序测定2次。如第1次检测序号为1、2、3、4、5、6、7、8，第2次为8、7、6、5、4、3、2、1。当天的方法比较实验应在2小时内完成。
A.4.2.2.3.        数据分析
A.4.2.2.3.1.        初步判断：剔除有明显人为误差的结果。内部质控失控时，必须重新检测。
A.4.2.2.3.2.        离群点的剔除：设比较方法测定结果为x值，第一次测定值为x1，第二次测定值为x2。。实验方法测定结果为y值，第一次测定值为y1，第二次测定值为y2。。
A.4.2.2.3.3.        方法内重复测定值离群点的去除
计算△xi=∣xi1-xi2∣; △yi=∣yi1-yi2∣
计算 ；
计算4 ，4
以4 和4 为离群限值，如果没有超出，继续方法间配对结果离群点检验；否则继续相对差异检验，进行如下最终判断
计算 ；
计算 ；
最终以4 和4 为判断离群点限值
A.4.2.2.3.4.        方法间配对结果离群点的去除
计算Eij＝∣yij-xij∣,i为标本序号1～40，j为重复结果序号1或2。
计算
以4 为离群限值。如果全部实验数据中离群点超过2个，应补充实验数据。
A.4.2.2.3.5.        初步判断线性回归状况
x－y散点图
以比较方法所有结果为x值，实验方法所有结果为y值，绘制散点图。
以比较方法每个标本两次检测结果的均值为x值，实验方法每个标本两次检测结果的均值为y值，绘制散点图。比较两图有无明显差异。如无明显差异，说明方法比较实验的随机误差对比较结果影响不大。
x均值（x－y）均值差散点图
以比较方法每个标本两次检测的均值为x值，两方法实验结果均值差（x－y）为y值，绘制散点图。观察均值差随x值增大的变化。如果点的分布表现出一定的趋势，预示着两方法之间系统误差的存在。
A.4.2.2.3.6.        标本分析物浓度分布检验
实验点的离散度和对应分析物浓度分布的宽度都会影响r值的大小。一般如果r≥0.975（r2≥0.95），x取值范围适宜，否则应扩大数据范围。
A.4.2.2.3.7.        线性回归计算
每份标本用两个方法进行两次测定。将比较方法的x1和实验方法的y1对应，比较方法的x2和实验方法的y2对应，组成成对数据。采用所有成对数据进行直线回归。得回归方程 。理想状态下 ，即b＝1， ＝0。如果b≠1， ≠0，说明两方法间存在系统误差，需要对误差进行评估。如了解Y方法引入后相对于X方法在临床决定水平浓度xc处的系统误差（SE）。

A.4.2.2.4.        可接受标准
A.4.2.2.4.1.        r≥0.975或r2≥0.95
A.4.2.2.4.2.        医学决定水平xc处新方法引入的系统误差小于CLIA'88允许误差的1/2。

A.4.3        精密度的估计
精密度估计最常用的方法是采用稳定的标本进行重复检测。求得均值（x）、标准差(s)和变异系数（CV）。精密度的好坏通常采用不精密度表示，不精密度通常以CV体现。应在明确标本的来源、浓度、实验周期的前提下，确定检测方法的不精密度。
A.4.3.1        标本的选择
A.4.3.1.1.        标本分析物浓度范围：鉴于血站血液检测实验室检测对象为健康的献血人群，可采用中、低两个ALT浓度的标本进行精密度实验。标本的基质应近似于人源标本。
A.4.3.1.2.        标本的保存：精密度实验需要在若干天内完成，对于冰冻保存的标本和冻干复溶标本，应严格控制操作手法均一、复溶时间、加液的准确性、混匀的力度等，力求实验标本的稳定、均一。
A.4.3.2        实验程序
A.4.3.2.1.        对每个水平的标本分别做批内和天间的重复测定。精密度实验与常规标本检测同时进行，不可替代实验的质量控制过程。
A.4.3.2.2.        批内实验：将实验标本插入常规检测标本一同检测。一批内连做20次。对应质控结果为受控状态。
A.4.3.2.3.        批间实验：每天对实验标本做1次检测，连做20天。每天对应质控结果为受控状态。
A.4.3.3        数据分析
A.4.3.3.1.        标准差计算
批内和天间标准差均可采用以下公式计算

A.4.3.3.2.        变异系数计算
批内和天间变异系数均可采用以下公式计算
×100
A.4.3.4        可接受标准
参照Westgard和Ceroblewski等提出高效检验对精密度要求的观点，批内不精密度CV应小于CLIA允许误差的1/4，批间不精密度CV应小于CLIA允许误差的1/3。对于ALT实验，CLIA允许误差限值T±20%，因此ALT检测方法的批内不精密度CV应小于5%，批间不精密度CV应小于6.7%。

A.4.4        检测可报告范围
检测可报告范围确认实验通常采用配制包含不同分析物浓度的系列标本进行检测，将按稀释比例计算的预期值和实际测量值设置为两个变量进行线性回归。回归直线应当为过原点，斜率为1的直线。直线所达的限值即为结果的检测范围。
A.4.4.1        标本的选择
准备一份ALT<30IU的低浓度血清（L）和ALT在500IU左右的高浓度血清（H）。将高低两份血清按照5L, 4L+1H, 3L+2H, 2L+3H, 1L+4H, 5H的比例配制混合，形成系列血清。
A.4.4.2        实验程序
检测系列血清，每份标本重复4次。
A.4.4.3        数据分析
A.4.4.3.1.        剔除异常点：剔除明显异常的检测结果，并补充数据。
A.4.4.3.2.        计算预期值：计算低值和高值标本的结果均值。按照稀释关系，计算每个标本的分析物理论浓度，即为预期值。
A.4.4.3.3.        预期值－实测值的线性回归：每个标本有4个重复实验的实测值。每个实测值与其预期值相对应，形成成对数据。以x表示预期值，y表示实测值，描点绘图。得到回归方程 。
A.4.4.3.4.        初步判断：理想状态下 中b＝1， ＝0。但实际工作中很难达到。因此如果b在1.00±0.03的范围内， 近于0，则可直接判断该方法可报告范围在实验涉及浓度范围内。
A.4.4.3.5.        如果b不接近1， 较大，应具体分析高浓度还是低浓度的预期值和实测值存在较大偏倚。可以舍去某组数据，重新进行回归计算。如果缩小范围后，b和 能够满足要求，即说明缩小的浓度范围即是实际的检测范围。
A.4.4.3.6.        可以通过以下统计假设检验进行判断。
A.4.4.3.6.1.        截距a和0差异的t检验
假设H0：a=0；H1: a≠0；
计算
计算
计算 ，

A.4.4.3.6.2.        斜率b和1差异的t检验
假设H0：b=1；H1: b≠1；
计算
计算
计算 ，

A.4.5        正常值参考范围确认
采用新方法对20份健康献血者血液标本进行检测。最多允许1个结果不在试剂盒提供的参考范围内。

A.5         ABO血型和Rh(D)抗原检测方法的确认
以下内容适用于献血者血型血清学方法确认。
A.5.1        确认的一般要求
A.5.1.1        实验操作的培训
开始确认新的检测方法之前，操作人员应当有充分的时间熟悉新系统，确定关键的操作步骤。生产商应提供试剂或仪器的操作说明，实验原理，规格，实验步骤，局限性，质量控制和健康安全信息。生产商应对操作者进行培训，确保操作人员正确操作。
A.5.1.2        试剂的准备
应选择国家批准使用的血型试剂，严格遵从生产商的说明书进行操作。对于正在进行确认的试剂，所有组份应来源于同一批试剂，不能由其他试剂所替代（即使另一种试剂为同一厂家生产）或实验室自己配制。实验室对试剂自行修改，如稀释试剂，应取得生产商的认可，因为任何修改可以导致对试剂的质量保证失效，并产生相关责任。
A.5.1.3         仪器的准备
应选择国家批准使用的检测仪器。实验开始前，按照要求对仪器进行维护校准。对于开放试剂的仪器设备，特别注意试剂说明书要求的操作条件与仪器性能是否相适应。如果仪器性能与试剂盒说明书的要求有差异，可以征得试剂生产商协助和同意，对本实验室仪器的实验操作参数进行修正，以达到试剂盒要求的实验状态。
A.5.1.4         质量控制
应建立有效的质量控制程序。确保常规平行实验中已知抗原和已知抗体的质控物反应正确，否则必须重新实验。
A.5.1.5         保持实验记录
应记录和监控操作人员在实验过程中的健康安全，确保符合法律要求。保留检测全过程的数据和结果，包括检测的速度和使用的适宜性等。
A.5.2        平行确认实验
所有实验室应采用平行实验的方式，用常规标本，将新方法与现用方法进行比较，确认新方法的常规使用状态。实验时间最短1周。操作程序和实验结果应文件化。应定期进行关键标本（弱抗原或弱抗体标本）重复实验，确认方法的稳定性和耐用性。

A.6         确认记录
A.6.1        实验过程记录应包括
A.6.1.1        检测标本类型及各类型数量；
A.6.1.2        检测日期；
A.6.1.3        操作实验者的级别和能力；
A.6.1.4        使用试剂的详细资料，包括：批号、效期等；
A.6.1.5        采用修正条件的详细资料，如温度、孵育时间，离心力、加速减速率、离心时间；
A.6.1.6        设备详细资料；
A.6.1.7        判读方法的详细资料，包括适当的cutoff值。
A.6.2        实验结果记录应包括
A.6.2.1        所有结果并绘制表格，包括阳性反应和阴性控制结果；
A.6.2.2        差异结果、数量和类型，以表格形式体现。
A.6.3        确认结论记录应包括
A.6.3.1        用户界面友好性；
A.6.3.2        操作人员需要的水平，培训要求；
A.6.3.3        新产品/系统的实用性、耐用性，自动化效能；
A.6.3.4        不同情况下使用的适宜性（批量标本处理或单一紧急标本处理）；
A.6.3.5        新产品/系统的贮存期，包括贮存末期的性能；
A.6.3.6        方便的仪器维护；
A.6.3.7        健康安全方面，包括数据采集和处理安全性；
A.6.3.8        任何过程中暴露的系统弱点和对系统改进的建议，并通知生产商，如果生产商对此实施了改进方案，重新实验的结果应在报告中体现。

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5 血型检测
5.1  红细胞血型检测
5.1.1  红细胞血型血清学检测技术规范
5.1.1.1  对标本的一般要求       
5.1.1.1.1  实验室所检测标本须有清晰的惟一性标识。
5.1.1.1.2  标本须和血液、血液成分制品来自于同一献血者。
5.1.1.1.3  所检测的标本可为抗凝的或不抗凝的标本。抗凝剂推荐使用乙二胺四乙酸（EDTA）。
5.1.1.1.4  须遵守试剂/仪器使用说明书中所限定的标本制备和保存步骤；当说明书内容不能涵盖相关要求时，可用经确认的标本制备和保存步骤。
5.1.1.1.5  肉眼判定标本是否存在影响检测结果的因素,如溶血、脂血等。
5.1.1.2  仪器设备的要求
5.1.1.2.1  仪器设备在安装后，需校准方可使用，校准周期至少一年一次，仪器设备需有维护程序。所有的校准、维护须有记录。
5.1.1.2.2  仪器设备所使用的软件和实验室的信息系统须经过确认。
5.1.1.3  记录的要求
5.1.1.3.1  所有检测标本具有可追溯性。
5.1.1.3.2  核对当前ABO/RhD定型结果与既往的血型记录是否一致，结果不一致必须查找原因。
5.1.1.4  ABO/RhD定型
5.1.1.4.1  原理
5.1.1.4.1.1  根据红细胞上和血清（或血浆）中有或无A抗原或/和B抗原及其抗体，将血型分为A型、B型、AB型及O型四种。可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。正定型是用已知抗-A或抗-B定型试剂来测定红细胞上有无相应的A抗原或/和B抗原；反定型是用已知A型细胞和B型细胞来测定血清中有无相应的抗-A或/和抗-B。
5.1.1.4.1.2  利用红细胞凝集试验，通过抗-D定型试剂，测定红细胞上是否存在RhD抗原。红细胞上有RhD抗原称RhD阳性，无RhD抗原为RhD阴性。
5.1.1.4.2  试剂与材料
5.1.1.4.2.1  所有用于检测与确认的ABO血型定型试剂都必须符合国家相关规定。
5.1.1.4.2.2  按照试剂使用说明书的要求配制红细胞悬液。如果说明书中无具体要求，建议的红细胞悬液浓度为：试管法、微量板法2-5％，微柱凝胶法0.8-1％。
5.1.1.4.3  技术要求
5.1.1.4.3.1  需用抗-A和抗-B试剂测定红细胞；用A1和B红细胞测定血浆或血清，进行ABO定型。正反定型结果不一致或有疑问，需进一步进行ABO血型确认试验(见5.2.2)。
5.1.1.4.3.2  需用抗-D试剂测定RhD血型；红细胞在直接凝集试验中被IgM抗-D凝集的和在RhD阴性确认试验中被任何一种抗-D凝集的都应标记为Rh阳性。在直接凝集试验和在RhD阴性确认试验中与任何一种抗-D都不凝集的血液需标记为RhD阴性。红细胞与IgM抗-D定型试剂在直接凝集试验中不凝集的标本，需进一步进行Rh阴性确认试验(见5.2.4)。
5.1.1.4.3.3  试管法、微量板法、微柱凝胶法都适用于标本的ABO/RhD定型。
5.1.1.4.4  注意事项
5.1.1.4.4.1  ABO/RhD定型试验需在适应的实验温度中进行。一般实验温度应保持在18-25 ℃。
5.1.1.4.4.2  确认ABO/RhD血型所用的试剂与检测定型的试剂须来自不同的细胞株。
5.1.1.4.4.3  ABO/RhD 血型的鉴定可用经验证有效的基因诊断的方法，通过鉴定相关血型基因来完成ABO/RhD基因定型。
5.1.1.4.5  ABO/RhD定型质控
5.1.1.4.5.1  检测标本时必须设立阳性和阴性对照试验：对照试验的频次取决于工作模式、使用的方法和试剂的使用说明。
表5.1.1.1  AB0/RhD定型试验阳性对照、阴性对照所选用的细胞
试剂        阳性对照        阴性对照
抗-A        A细胞        B细胞
抗-B        B细胞        A细胞
抗-D        RhD-阳性细胞        RhD-阴性细胞
A1分型细胞        抗-A        抗-B
B分型细胞        抗-B        抗-A
5.1.1.4.5.2  每一批抗-A，抗-B，都必须与A1，B和O细胞有合适的反应能力。每一批试剂反定型红细胞都必须与抗-A，抗-B有合适的反应能力。
5.1.1.4.5.3  每批抗-D定型试剂都必须与R1r有合适的阳性反应能力，同时与r'r或rr细胞不凝集。
5.1.1.5  不规则抗体筛选
5.1.1.5.1  原理
用已知抗原表型的试剂红细胞组，通过直接凝集试验和间接抗球蛋白试验，筛选标本中可能存在的血型同种免疫性抗体。避免含有临床意义的血型同种抗体随血液、血液成分制品一同输入。
5.1.1.5.2  试剂与材料
用于筛选的试剂红细胞必须来自至少两名无关O型供者，要求一种细胞为R1R1，另一种为R2R2表型，且表达下列抗原：M，N，S，s，Mur，Dia，k，Fya，Fyb，Jka，Jkb 和 Lea。并尽可能多的包含Duffy, Kidd血型系统中主要抗原的纯合子以及低频率抗原。不可通过混合来自不同供者的细胞获得需要的抗原表达范围。
5.1.1.5.3  方法
用于标本抗体筛选实验的技术包括：经典的血型血清学盐水悬浮细胞凝集试验、间接抗球蛋白试验以及各种改良的间接抗球蛋白试验；非经典的抗原抗体检测技术包括免疫荧光技术、放射免疫技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）、固相红细胞粘附试验以及凝胶试验。不同方法的可靠性存在差异，应根据要求选择相应方法。
5.1.1.5.3.1  盐水悬浮细胞凝集试验:在试管或微量板中将血浆(血清)与筛选细胞1:1混合。室温立即离心和/或37℃孵育30分钟后离心判读结果。
5.1.1.5.3.2  间接抗球蛋白试验:在试管或微量板中将血浆(血清)与筛选细胞1:1混合, 37℃孵育30分钟后，弃去上清，用生理盐水洗涤三次红细胞。加抗人球蛋白试剂，离心判读结果。
5.1.1.5.3.3  必须对筛选检测出的抗体进行鉴定，评估其临床意义。不进行抗体鉴定的实验室需将抗体筛选阳性标本送至具有资质的参比实验室进行最后鉴定或确证。
5.1.1.5.4  注意事项
5.1.1.5.4.1  有些抗体(如-Lea,-Jka)在盐水悬浮细胞凝集试验中可溶解抗原不配合的红细胞。
5.1.1.5.4.2  在进行间接抗球蛋白试验时，必须有IgG致敏的红细胞作为阳性对照。同时需定期使用含临床意义的弱抗体附加对照试剂 (如抗Fya或抗-Jka) 以确保试验步骤的敏感性和试剂红细胞抗原表达的完整性。
5.1.1.5.4.3  其它方法如果已经验证和证明其适用性，可作为间接抗球蛋白试验的补充 (而非替代)，如酶处理技术或聚凝胺方法。但对某些临床重要性抗体，间接抗球蛋白试验优先于其它可选择技术。
5.1.1.5.4.4  注意血清与红细胞的比率，特别是使用Liss和PEG等促凝剂时，适当增加血清比例，防止弱抗体的漏检。
5.1.1.5.4.5  抗体筛选应能检出浓度不高于0.5 IU/mL的抗-D。
5.1.1.6  附加实验
5.1.1.6.1  实验室可根据临床的需求，对标本开展稀有血型的筛选。
5.1.1.6.2  实验室可根据临床的要求，对标本开展HLA和粒细胞抗体的筛选。
5.1.1.7  质量控制
5.1.1.7.1  检测过程中必须开展室内质量控制，检测当天至少做1次室内质量控制。
5.1.1.7.2  推荐使用具有弱抗体或具有弱阳性直接抗球蛋白试验（DAT）结果的红细胞作为质控品，来评价实验室是否能检出弱凝集。
5.1.1.7.3  实验室必须至少参加一项由加国家有关部门认可或得到认证的机构组织的室间质量评价活动。
5.1.2  红细胞血型血清学检测操作规程
5.1.2.1  ABO定型
5.1.2.1.1  原理
根据红细胞上有无A抗原或(和)B抗原，将血型分为A型、B型、AB型和O型四种，可利用红细胞凝集试验通过正(血清试验)反(细胞试验)定型准确鉴定ABO血型。
ABO血型的鉴定必须用已知抗-A和抗-B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原、B抗原，用已知混合的A型红细胞和B型红细胞检测血清中有无相应的抗-A、抗-B，这两种试验可以作为相互验证的质量控制方法。
5.1.2.1.2  试剂与材料
抗-A和抗-B定型试剂；抗-AB定型血清； A、B及O型试剂红细胞；受检者血清；受检者红细胞盐水悬液或全血。
5.1.2.1.3  方法和结果解释
5.1.2.1.3.1玻片试验测定红细胞ABO血型
A.  在标记的玻片上分别加1滴抗-A、抗-B、抗-AB，各加1滴红细胞悬液(按试剂说明书的要求配置受检者红细胞浓度)；
B.  用干净的加样棒将红细胞悬液和试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖大约20mm×20mm的面积；
C.  缓慢连续倾斜转动玻片2分钟，观察结果并解释。不要把玻片放在加热的表面物上，以防水份蒸发。
D.  结果解释
a.  凝集为阳性结果；
b.  细胞均匀悬液2分钟后为阴性结果；
c.  对结果有怀疑，应用试管法重新实验。
E.  注意事项
a.  玻片试验不适用于患者和献血者血清中的ABO抗体测定。
b.  不要混淆干燥的边缘与凝集。
5.1.2.1.3.2  试管试验测定红细胞及血清ABO血型
A.  细胞定型 (正定型)
a. 取洁净小试管3支，分别标明抗-A、抗-B和抗-A+B，用滴管分别加1滴抗-A、抗-B和抗-A+B；
b.  在每个试管中各加1滴2～5%受检者的红细胞悬液；轻轻混匀，根据试剂使用说明书进行离心。通常的条件是离心900～1000g, 15～30秒；
c.  轻轻重悬细胞扣，检查凝集；判读结果，与血清定型结果比较。
B.  血清定型 (反定型)
a.  取洁净小试管2支，分别标明A1、B细胞。用滴管分别加入受检者血清1滴 (注：根据需要可加A2和O细胞)；
b.  在标记A1的试管中加1滴A1试剂红细胞；在标记B的试管中加1滴B试剂红细胞；
如需要可加A2和O细胞；轻轻混匀试管，根据试剂使用说明书进行离心。通常的条件是900～1000g, 15～30秒；
c.  检查上清液有无溶血，轻轻重悬细胞扣，检查凝集；判读结果，与细胞定型结果比较。
C.  结果解释
a.  细胞定型试验的凝集及血清试验的溶血或凝集都表示阳性结果；
b.  重悬细胞扣后的均匀的红细胞悬液表示阴性结果；ABO细胞及血清试验的结果和解释见表5.1.2.1；
c.  若正反定型结果不符，应进一步试验以确定血型。
5.1.2.1.3.3  微量板试验定红细胞及血清的ABO血型
微量板可以是U型或V型底，硬质塑料或软质塑料，96孔板或120孔板，可通过离心微量板或是将板放置一定角度观察结果。
A.  细胞定型 (正定型)
a.  在微量板的两个干净孔内分别加入1滴抗-A、抗-B，（如需要，可在第三孔内加1滴抗-AB试剂）；
b.  在含有血型定型试剂的各孔内加1滴2%红细胞悬液；轻叩板边，混匀孔内物质；
c.  离心200g，30～60秒；用手轻叩板或借助振荡器重悬细胞扣；判读结果，比较血清试验的结果。
B.  血清定型 (反定型)
a.  在微量板的两个干净孔内，每孔内加1滴受检者血清或血浆；
b.  在含有血清或血浆的各孔内分别加1滴2%A1和B细胞(如需要，可在第三、四孔内各加1滴A2或O细胞)；轻叩板边，混匀孔内物质；
c. 离心200g，30～60秒；用手轻叩板或借助振荡器重悬细胞扣；判读结果，比较细胞试验的结果。
C.  结果判读与解释
a.  细胞定型试验的凝集及血清试验的溶血或凝集都表示阳性结果；
b.  重悬细胞扣后，均匀的红细胞悬液表示阴性结果；ABO细胞及血清试验的结果和解释见表5.1.2.1；
c. 若正反定型结果不符，应进一步试验以确定血型。
表 5.1.2.1  ABO血型正、反定型试验结果
受检者红细胞与定型血清的凝集反应        受检者血清与试剂红细胞的凝集反应        结果判读
抗-A        抗-B        A细胞        B细胞        O细胞        ABO血型
-        -        +        +        -        O
+        -        -        +        -        A
-        +        +        -        -        B
+        +        -        -        -        AB
注：+:凝集，-:不凝集
D.  注意事项
O型红细胞在ABO反定型试验中作为一个对照细胞可检出抗H(如孟买型)、缗钱状凝集以及检查血清中存在的与血型抗原抗体无关却能使细胞发生凝集的某些物质。
5.1.2.2  ABO亚型鉴定
ABO抗原的亚型或变异型很多，在A抗原中主要为A1和A2，其它A亚型不多见，而B亚型一般比A亚型更少，区分ABO亚型，可根据：
红细胞与抗-A、抗-A1、抗-B及抗-AB的凝集程度；
红细胞上的H物质活性的强弱；
血清中是否存在抗-A1和不规则抗-B；
分泌型人唾液中A、B、H物质。
5.1.2.2.1  A1和A2亚型鉴定
5.1.2.2.1.1  原理
抗-A血清中含有抗-A和抗-A1两种抗体，抗-A可以凝集A型和AB型红细胞，而抗-A1只能与部分A型和AB型红细胞反应，据此凡与抗-A1强反应者被定为A1或A1B型，不与抗-A1反应，而与抗-A强反应者被定为A2或A2B型。
5.1.2.2.1.2  试剂与材料
抗-A1定型血清；受检者2～5%的红细胞悬液；已知A1和A2型2～5%红细胞盐水悬液。
5.1.2.2.1.3  方法
A.  在1支标记的干净试管中加1滴抗-A；在另1支标记的干净试管中加1滴抗-A1；
B.  在每个试管中分别加入1滴2～5%受检者的红细胞悬液；轻轻混匀，根据厂商的试剂使用说书明进行离心。通常的条件是室温、900～1000g离心, 15～30秒；同时，用已知的A1和A2试剂红细胞作为对照，进行平行对照试验；
C.  轻轻重悬细胞扣，检查凝集；判读结果。
5.1.2.2.1.4  结果判读
如A1对照红细胞凝集，而A2对照红细胞不凝集，受检者红细胞凝集者为A1，不凝集者为A2。
5.1.2.2.1.5  注意事项
A.  检查时必须掌握反应时间；
B.  如A1和A2对照红细胞都凝集，表示抗-A1血清有异常；如A1和A2对照红细胞都不凝集，可再延长观察时间，如始终不凝集，也证明抗-A1血清有异常。
C.  新生儿红细胞ABO血型抗原较弱，不宜作亚型鉴定。
5.1.2.2.2  用吸收和放散法鉴定其他弱A或弱B亚型
5.1.2.2.2.1  原理
有弱A或弱B抗原的红细胞不被抗-A或抗-B所凝集，但可以吸收这种特异性抗体。用放散法除去吸收的抗体就能证实与已知特异性抗体反应的抗原活性物质的存在。
5.1.2.2.2.2  试剂与材料
人血清(多克隆)抗-A或/和抗-B（注：因为一些单克隆ABO定型试剂，对pH及渗透压的变化敏感，所以不适用吸收、放散试验）；放散试剂：（见5.1.2.7 放散试验)；受检者红细胞。
5.1.2.2.2.3  方法
A.  用盐水至少洗涤1ml受检细胞3次，最后一次洗涤后移除上清液；
B.  在洗涤过的红细胞中加入1ml抗-A试剂(鉴定弱A变异型)或1ml抗-B试剂(鉴定弱B变异型)；
C.  充分混均红细胞和抗血清，把混合物置4℃中1小时；离心混合物，移除上层抗血清；将红细胞转入一个干净试管；
D.  用大量4℃冷盐水(1ml或更多)至少洗涤红细胞6次，留下最后1次洗涤的小部分洗涤液作游离抗体检测。或者用O型细胞作为对照细胞与被检细胞平行做吸收放散试验；
E.  使用适合于将ABO抗体从红细胞上解离下来的放散方法，如热放散，从细胞上放散出吸收的抗体（（见5.1.2.7 放散试验)）；
F.  离心，将上层放散液转入1个干净试管；
G.  检测放散液及最后洗涤液(上述第D步)：所有放散液及最后洗涤液加1滴相应细胞，离心后放置于4℃30分钟后检查凝集状况。
H.  37度，孵育15分钟后，将步骤G中的样本进行间接抗人球蛋白试验。
5.1.2.2.2.4  结果判读
A.  如果放散液与抗原阳性细胞反应，最后洗涤液与抗原阳性细胞不起反应；或者O型对照红细胞平行试验放散液与抗原阳性细胞不起反应；则放散液中存在抗-A或抗-B，细胞上存在A或B抗原。
B.  如果放散液不与A或B细胞发生反应，可能表明细胞上没有抗原表达，不能吸收相关抗体，或是放散液制备失误造成。如果放散液与一些所有A或B细胞，也与一些或所有O细胞起反应，表明在吸收放散过程中，重新获得了一些其他的或附加的抗体。
C.  如果最后洗涤液或O型红细胞对照放散液与A或B细胞起反应，则认为试验是无效的。其原因可能是放散前未结合的抗体没有充分去除或是细胞没有充分洗涤，还可能是结合的抗体在洗涤过程中分离。
5.1.2.2.3  A、B、H、Le(a)和Le(b)唾液试验
5.1.2.2.3.1  原理
人群中约有78％的人含有Se基因，它能控制分泌可溶性ABH抗原物质，进入体液(脑积液除外)。抗体能与具有相应抗原的红细胞发生特异性凝集。体液中的可溶性抗原物质能与该抗体发生中和反应，抑制抗体凝集作为反应指示的红细胞。利用血凝抑制方法，把唾液中可溶性A、B、H、Lewis血型物质和相应的抗体中和，然后加入相应细胞。如果这些细胞凝集就表示唾液中不含有相应的可溶性抗原；若不凝集，就表示唾液中含有相应的可溶性抗原，即为分泌型。
5.1.2.2.3.2  唾液的留取
A.  刷牙或漱口后，收集5～10ml唾液于小烧杯或大口试管中，咀嚼蜡、石蜡、橡皮条能帮助收集唾液，不能咀嚼口香糖或任何其它含糖或蛋白的东西；
B.  离心900～1000g，8～10分钟，将上清液移入干净试管，煮沸8～10分钟以灭活唾液酶；
C.  离心900～1000g，8～10分钟，取清亮或微呈乳白色的上清液，将不透明或半固体状的物质丢弃；
D.  几小时内实验，标本须冷藏；几天内实验，样品须-20℃保存，冰冻保存的样品活性可持续几年。
5.1.2.2.3.3  试剂与材料
人源性(多克隆)抗-A和抗-B（注：单克隆试剂可能造成假抑制）；抗H：植物凝集素，可从金雀花种子的盐水浸出液中制备，也可用单克隆抗H，但须事先证明该抗H可以和唾液中H物质反应；多克隆(兔、羊)抗Le(a)；A1型B型红细胞；O型，Le(a+b-)红细胞；冰冻或新鲜的样品及用作阳性、阴性对照的分泌型，作分泌型者的唾液；经处理后的受检者唾液。
5.1.2.2.3.4  方法
A.  选择血型试剂的最佳稀释度：倍量稀释抗血清，在每一稀释度的1滴抗血清中加入1滴相应2～5%红细胞,离心，选择凝集强度为2+的最高稀释度的抗血清；
B.  在四只试管中加入1滴最佳稀释度的血型试剂，A、B、H唾液实验分别标明："分泌型"，"非分泌型"，"盐水"，"测定者"；Lewis唾液试验则标明"Lewis阳性"，"Lewis阴性"，"盐水"，"测定者"；
C.  在"分泌型"，"非分泌型"，"测定者"试管中，加入1滴相应的唾液，"盐水"管中加入1滴盐水,混匀置于室温10分钟；
D.  在每支试管中加入相应的红细胞1滴,混匀置于室温30～60分钟,离心,目测结果。
5.1.2.2.3.5  结果判读
A.  细胞与试管中的抗体发生凝集反应，表明该唾液不含有相应抗原；
B.  细胞与已知抗体不发生凝集反应，表明唾液中含有相应的抗原；
C.  细胞不与唾液对照管的抗体凝集，唾液试验结果无效，通常是由于试剂的稀释度太大，应重新选择合适的稀释度做试验。
5.1.2.2.3.6  注意事项
A.  用已知分泌型和非分泌型人的唾液作为试验的对照。对于ABH物质测定，使用经检验为Se和sese人的唾液；对于Lewis试验，使用Le(a+b-)或Le(a-b+)表现型的人红细胞作为阳性对照。阴性对照是Le(a-b-)的红细胞。试剂对照用盐水。
B.  可以使用唾液的连续盐水稀释法来做血型活性物质的半定量测定，除去已知活性所需要的稀释度愈高，存在于唾液的血型物质就愈多。必要时要在与抗体孵育前稀释唾液。
C.  Lewis阳性的人被证明是A、B和H分泌者，可以假定其唾液也含有Le(b)和Le(a)物质，若Le(a)阳性者是ABH非分泌型，缺乏Se基因，则在唾液中仅有Le(a)。
D.  如果唾液在加热前不先离心并除去沉淀，则可以从可能存在的细胞中释放H物质，使非分泌型导致假阳性。
E.  欲从唾液中得到清晰的不含有粘液的液体，可先将唾液冰冻保存数天，融化后离心，除去细胞碎屑。
F.  为了防止弱分泌型的漏检，可同时作盐水对照试验，比较二者凝集强度。
5.1.2.3  Rh血型鉴定
5.1.2.3.1  原理
Rh血型系统目前共有47个抗原，其中最常见的主要有C,c,D,E,e 5种。可分别用抗C、抗c、抗D、抗E、抗e这5种Rh定型试剂通过血凝试验来检查红细胞上是否存在相应抗原。在临床输血中，一般只做D抗原的鉴定。凡被检红细胞和抗D试剂凝集者为RhD阳性，不凝集者为RhD阴性。其它Rh抗原鉴定和D抗原一样，只是加相应的定型试剂即可。根据所选试剂的恃性，RhD血型的鉴定方法可采用试管直接盐水凝集法，酶技术、抗人球蛋白技术、聚凝胺、微柱凝胶等。
5.1.2.3.2  试剂与材料
RhD定型试剂：包括多克隆高蛋白、化学修饰低蛋白或混合型IgM/IgG，单克隆/多克隆低蛋白的试剂；RhD对照试剂(制造商不同对照试剂也不同，可根据试剂的使用说明选择)；
受检者红细胞悬液；已知RhD阳性和阴性红细胞各1份。
5.1.2.3.3  方法
5.1.2.3.3.1  玻片RhD抗原定型试验
5.1.2.3.3.1.1  在一块标记的干净玻片上加1滴抗D定型试剂；
5.1.2.3.3.1.2  在第二块标记的玻片上加1滴合适的对照试剂；
5.1.2.3.3.1.3  在每块玻片上加2滴受检者40～50%红细胞悬液；
5.1.2.3.3.1.4  用玻棒将细胞悬液试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖玻片20mmx20mm面积；
5.1.2.3.3.1.5  把两块玻片同时放在观察箱上，缓慢连续倾斜转动并观察凝集。多数试剂要求试验必须在2分钟内判读结果，因为孵育会导致混合物的干涸，有可能被误认为是凝集。
5.1.2.3.3.1.6  解释和记录结果。
5.1.2.3.3.1.7  结果解释
A.  当含有抗D试剂的玻片上出现红细胞凝集而对照玻片上是均匀的红细胞悬液时为阳性结果；
B.  当含有抗D试剂的玻片和对照玻片上都是均匀的细胞悬液时，提示是阴性结果，如果要进行RhD阴性确认试验，则必须采用其它的方法。
C.  如对照玻片上出现凝集，在未经进一步试验之前，不能解释为阳性结果；
D.  玻片边沿附近的干涸不应该混淆为凝集。
5.1.2.3.3.2  试管盐水直接凝集RhD抗原定型试验
5.1.2.3.3.2.1  在1支标记的干净试管中加入1滴抗D定型试剂；在第2支标记的试管中加入1滴合适的对照试剂；
5.1.2.3.3.2.2  在每支试管中各加1滴2～5%受检者的红细胞悬液；轻轻混合，离心；
5.1.2.3.3.2.3  轻轻重新悬浮细胞扣，检查凝集。
5.1.2.3.3.2.4  结果解释
A.  当含有抗D试剂的试管出现2+或2+以上的凝集而对照管呈现均匀悬液，是阳性结果；
B.  如含有抗D试剂的试管凝集低于2+或1+低于阳性对照，或对照管出现凝集，在未经进一步试验之前，不能解释为阳性结果；
C.  含有抗D试剂的试管和对照管都是均匀悬液者，提示可能是阴性的实验结果。被检红细胞可疑为RhD阴性。
5.1.2.3.3.3  微量板RhD抗原定型试验
以下介绍的是通常的微量板鉴定RhD血型技术。可根据试剂使用说明书中的要求，使用特定的试剂与仪器。
A.  在一个干净的微量板孔内加1滴抗D试剂，如试剂需要RhD对照，在第二个孔内加1滴对照试剂；
B.  在每一个孔内加1滴2%～5%的红细胞悬液，轻叩微量板边缘，混匀,离心200g 30～60秒；
C.  用手工或借助振荡器重悬细胞扣，判读，解释记录结果；
D.  阴性结果孵育37℃15～30分钟,离心200g 30～60秒,用手工或借助振荡器重悬细胞扣,判读，解释，记录结果。
5.1.2.4  RhD阴性确认试验
5.1.2.4.1  原理
由D抗原位点数减少或抗原结构产生变异所产生的一些弱D和不完全D红细胞，它们虽然有RhD抗原，但与常规使用的抗D定型试剂不凝集或弱凝集。确定这些红细胞上是否有D抗原存在需进一步采用含IgG抗D抗体的试剂进行抗球蛋白试验以提高试验灵敏度，达到检测弱D的目的，以及采用抗不同D表位的抗D抗体，测定37种D表位中的不同D表位，达到检测不完全D表型的目的。当确定红细胞上无D蛋白表达时，才能最终判定被检标本为RhD阴性。
5.1.2.4.2  试剂与材料
抗D定型试剂；IgM+IgG抗D；抗人球蛋白试剂，多特异性抗球蛋白或抗IgG；IgG致敏红细胞； 2～5%受检者的红细胞。

秋天de小志

5.1.2.4.3  方法
5.1.2.4.3.1  在1支标记的干净试管中加入1滴IgM抗D，在第2支试管中加入1滴合适的对照试剂；
5.1.2.4.3.2  在2支试管中各加入1滴2～5%受检者的红细胞悬液；
5.1.2.4.3.3  混匀，并在37℃孵育15～30分钟(根据试剂说明书)；900～1000g离心15～45秒；
5.1.2.4.3.4  轻轻重新悬浮细胞扣并观察凝集反应，如受检红细胞与抗D管凝集而与试剂对照管不凝集，可记录受检标本为阳性结果，不必作抗球蛋白试验；
5.1.2.4.3.5  如不凝集，则用大量盐水洗涤细胞3～4次；最后一次洗涤后，把盐水倾倒干净，吸干试管边缘；
5.1.2.4.3.6  加1～2滴抗人球蛋白试剂(根据试剂说明书), 轻轻混匀，并以900～1000g离心15～30秒；
5.1.2.4.3.7  轻轻冲洗悬浮细胞扣并观察凝集反应；
5.1.2.4.3.8  如果试验为阴性，加入已知IgG致敏红细胞，再次离心，检查凝集。
5.1.2.4.4  结果判读
5.1.2.4.4.1  抗D试管出现凝集而对照管无凝集时，是阳性结果，判为RhD阳性；
5.1.2.4.4.2  抗D试管无凝集反应者是阴性结果，表明红细胞没有D抗原，判为RhD阴性；
5.1.2.4.4.3  如果试剂对照管凝集，则不能对这次RhD阴性确认试验作出有效的解释，这种情况下，对择期受血者，在RhD血型未确定前，应先输RhD阴性血液；如果受检细胞是献血员，该血液不应用于临床。
5.1.2.4.5  注意事项
5.1.2.4.5.1  确认试验中所选用的IgM抗D单克隆抗体所识别的D表位应与初筛使用的IgM抗D识别的D表位不同。
5.1.2.4.5.2  本项试验中所检出的不完全D表型的进一步分类需使用特殊的不完全D诊断试剂。
5.1.2.4.5.3  可采用检测RhD基因的方法诊断RhD血型。
5.1.2.5  红细胞血型抗体筛选与鉴定技术
5.1.2.5.1  抗球蛋白试验
抗球蛋白试验又称Coombs试验，是一种检查IgG抗体的方法。将抗球蛋白试剂加入已致敏的红细胞盐水悬液中，致敏在红细胞表面的IgG抗体与抗球蛋白发生特异性反应，使红细胞发生凝集。
5.1.2.5.1.1  直接抗球蛋白试验
A.  原理
直接抗球蛋白试验是检查体内致敏红细胞的一种方法，用于检查红细胞是否已被IgG抗体所致敏，如新生儿溶血病（胎儿红细胞被母亲血型抗体致敏）、溶血性输血反应（输入的不相合红细胞被受血者IgG抗体致敏）、自身免疫性溶血性贫血（受血者红细胞被自身抗体致敏）以及药物诱导产生的自身抗体（由甲基多巴类药物，青霉素等所致）。
B.  试剂
抗球蛋白试剂（广谱及单价）；阳性对照管：取D阳性红细胞，经盐水洗涤后取压积红细胞，加等量IgG抗D血清，置37℃水浴致敏45分钟取出，以生理盐水洗涤3次后，离心除去上清液，再用盐水配成3～5%红细胞盐水悬液。阴性对照管：正常人5%D阳性红细胞悬液（未致敏），供阴性对照用，除不用抗D血清致敏外，按上法配制。
C.  方法
a.  取受检红细胞，以生理盐水洗涤3次，末次洗涤后将上层盐水倒尽，用滤纸将管口附着的盐水吸去，配成2～5%红细胞盐水悬液；
b.  取上述2～5%受检红细胞盐水悬液1滴，滴入小试管内，加抗球蛋白血清1滴，混匀。
c.  阳性对照：IgG抗D血清致敏的2～5%D阳性红细胞悬液1滴，加抗球蛋白血清1滴，混匀。
d.  阴性对照：正常人2～5%D阳性红细胞悬液1滴加抗球蛋白血清1滴，混匀；
e.  受检者以及阳性，阴性对照管同时离心120g，1分钟，或离心1000g ，15秒，轻轻混合，观察结果。
D.  结果判定
如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者为阳性，不凝集者为阴性。
E.  注意事项
a.  标本采取后立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞上放出。
b.  抗球蛋白血清应按说明书使用最适稀释度，否则，可产生前带现象，而误为阴性结果。
c.  受检红细胞一定要用盐水洗涤3次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。
d.  欲了解在体内致敏红细胞的免疫球蛋白类型，则可分别以抗IgG、抗IgM或抗C3单价抗球蛋白血清进行试验。
e.  红细胞上吸附抗体太少，自身免疫性溶血性贫血直接抗球蛋白试验可呈假阴性反应。
f.  全凝集或冷疑集血液标本及脐血标本含有Wharton胶，洗涤不充分，血液标本中有很多网织红细胞，且抗球蛋白血清中含有抗运铁蛋白时，都可使红细胞产生凝集。
5.1.2.5.1.2  间接抗球蛋白试验
A.  原理
用已知抗原红细胞测定受检血清中相应的IgG抗体，或用已知抗体的抗血清测定受检红细胞上相应抗原。常用于血型鉴定，抗体的检出和鉴定，输血前交叉配血试验以及其它的特殊研究。
B.  试剂与材料
抗球蛋白血清（广谱及单价）；受检血清（或已知抗体血清）； 2～5%已知抗原的红细胞悬液（或3～5%受检红细胞悬液）；IgG抗D血清；2～5%D阳性红细胞悬液,2～5%D阴性红细胞悬液。
C.  方法
a.  取试管3支，标明受检管，阳性对照及阴性对照；
b.  在受检管内加入2滴血清（已知或受检）及1滴2～5%红细胞悬液（受检或已知）；在阳性对照管中加入2滴IgG抗D血清及1滴2～5%D阳性红细胞悬液；在阴性对照管中加入2滴IgG抗D血清及1滴2～5%D阴性红细胞悬液。混匀，置37℃水浴45分钟用生理盐水洗涤3次。末次洗涤后，将上清液除尽，并用吸水纸将附着于管口的盐水吸去。每管各留红细胞悬液1滴；
c.  每管各加最适稀释度抗球蛋白血清1滴，混匀,900～1000g离心15秒，观察结果。
D.  结果判定
a.  阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检管出现凝集者为阳性，受检管不出现凝集为阴性。
b.  效价滴定：如果受检者血清中检出IgG抗体，可将受检者血清以盐水做倍量稀释后，按上法进行测定。
E.  注意事项
a.  红细胞洗涤应迅速，洗涤不应中途停止。洗涤用盐水要足量并用力冲入管底，使压积于管底的红细胞松离。切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防污染来自皮肤的蛋白。
b.  如果检查的抗体为补体依赖抗体，则必须加入新鲜AB型血清，抗球蛋白血清中也应含有抗C3。
5.1.2.5.2  凝胶凝集技术筛选和鉴定抗体
5.1.2.5.2.1  原理
在微柱凝胶试验中，用特制的微柱代替普通试管，微柱内注入葡聚糖、蛋白G或玻璃微珠等物质，并可在这些物质上预先分别结合上抗球蛋白抗体。由于凝胶颗粒具有分子筛作用，抗原抗体反应后的红细胞通过离心经过微柱，无IgG结合的红细胞穿过凝胶到达底部，而红细胞上若有IgG抗体结合则会被凝胶中的抗IgG拉住，红细胞被阻止在凝胶柱上层或中间。
5.1.2.5.2.2  标本与试剂
5.1.2.5.2.2.1  如果待测的血清和血浆是冰冻保存的，血样在使用前需离心，确保没有颗粒物质；
5.1.2.5.2.2.2  挑选抗IgG凝胶卡：检查每1个凝胶卡是否干涸是否完整，做好试验标记，若是抗体筛选可选择2～3个微量管，抗体鉴定则需与多个微量管(根据试剂红细胞谱的细胞品种选择微量管数，并注意留有自身与阳性对照)；
5.1.2.5.2.2.3  使用适用于微柱凝胶的试剂红细胞组，或参照试剂的要求制备红细胞悬液。通常配制0.8%红细胞悬液。
5.1.2.5.2.3  方法
5.1.2.5.2.3.1  揭开凝胶卡的铝封,在不同的微量管中，根据试剂使用说明书的要求分别加入一定量的(通常50ml)不同的筛选或鉴定试剂红细胞；
5.1.2.5.2.3.2  根据试剂使用说明书的要求在这些微量管中加入一定量的(通常25ml)血清或血浆；
5.1.2.5.2.3.3  将凝胶卡置37℃凝胶孵育箱15分钟；用凝胶试验离心机，离心观察结果。
5.1.2.5.2.4  结果判读与解释
5.1.2.5.2.4.1  细胞完全沉积在微量管底部为阴性结果；
5.1.2.5.2.4.2  所有细胞仍留在微量管顶部为强阳性结果；
5.1.2.5.2.4.3  凝集的强弱判断请参见图5.1.2.1。
图5.1.2.1凝胶检测反应级数图

5.1.2.5.3  聚凝胺试验
5.1.2.5.3.1  原理
聚凝胺是一种由四个铵聚合而成的高阳离子聚合体。聚凝胺可使正常红细胞聚集，而在加入柠檬酸盐时又可使聚集的红细胞散开。当红细胞上有IgG抗体结合时，聚凝胺所造成的凝集是不可逆的。在此实验中，红细胞与血清在低离子介质中孵育，以促进抗体结合到红细胞上。然后加聚凝胺，离心后通过加入柠檬酸盐使聚凝胺形成的凝集驱散。此时，由抗体介导的凝集在加入柠檬酸盐后仍然维持，而无抗体致敏的红细胞凝集则会散开。如果需使用加入柠檬酸盐后散开的红细胞做进一步的抗球蛋白试验，则散开后的细胞需先进过三次洗涤。
5.1.2.5.3.2  试剂
聚凝胺试剂盒：通常包括低离子介质(LIM)、聚凝胺溶液、重悬液：洗涤液(用于抗球蛋白试验)；抗人球蛋白试剂；IgG致敏红细胞。
5.1.2.5.3.3  方法
根据试剂使用说明书进行操作，一般情况下包括以下步骤：
5.1.2.5.3.3.1  各取1滴3～5%受血者和献血员红细胞悬液，洗涤去上清，受血者红细胞中加入0.1ml献血员血清，献血员红细胞中加0.1ml受血者血清；
5.1.2.5.3.3.2  各加1 mlLIM溶液，混合，室温孵育1分钟；
5.1.2.5.3.3.3  各加0.1ml 0.05%聚凝胺应用液，混匀；
5.1.2.5.3.3.4  离心900～1000g，10秒钟，悬浮细胞扣，并观察是否已产生凝集；
5.1.2.5.3.3.5  加0.1ml重悬液，轻轻摇动试管，并在3分钟内完成结果判读。
5.1.2.5.3.4  结果判读
当加入重悬液后，仍存在凝集为阳性反应。
5.1.2.5.3.5  注意事项
5.1.2.5.3.5.1  当使用低离子聚凝胺技术时，实验需有阴性对照。
5.1.2.5.3.5.2  如果反应很弱，可用显微镜观察并与阴性对照比较，不可再次离心。
5.1.2.5.3.5.3  聚凝胺方法对检测Kell系统的抗体不理想，所以对阴性结果须进行抗球蛋白试验，以免漏检。
5.1.2.5.4  酶技术
用于血库的酶制剂批与批之间均有差异，所以每次配制酶贮存溶液都需要测定其活力，为达到最佳效果，确定标准的孵育时间。
5.1.2.5.4.1  无花果酶贮存液的制备
(1)        将1g无花果蛋白酶倒入100ml容量瓶中，(注意！操作时须仔细，因为吸入或进入眼内都是有害的，建议戴手套、口罩或在通风橱内操作)。
(2)        加入pH7.3 PBS至100ml，溶解无花果蛋白酶，倾斜混匀至大部分溶解，但不会完全溶解；
(3)        离心或过滤后，收取上清液，分装小瓶，-20℃保存(不能反复冻融)。
5.1.2.5.4.2  木瓜酶贮存液的制备
(1)        在100ml PBS中加入2克木瓜酶粉剂。在室温中振动酶溶液15分钟。
(2)        通过离心或过滤收集上清液。加入L胱氨酸盐酸盐，在37℃中孵育1小时。
(3)        加pH5.4 PBS至200ml，分装后-20℃保存。(不能反复冻融)。
5.1.2.5.4.3  酶的标准化
每个新批号的贮存液需确定其最佳稀释度和孵育时间。
【试剂】
无花果酶PBS贮存液,pH7.3的PBS；不含有意外抗体的AB血清；只凝集酶处理的RhD阳性红细胞、不凝集未经酶处理的RhD阳性红细胞的抗D；抗Fya抗体； D及Fya均阳性的红细胞。
【方法】
(1)        1份无花果酶贮存液加9份pH7.3 PBS；
(2)        标记3支试管：5分钟，10分钟，15分钟；
(3)        在每一个试管中加等量的洗涤红细胞和0.1%无花果酶,混匀，并在37℃孵育一定时间，如果制备15分钟管，接着每隔5分钟制备10分钟和15分钟管，那么3支试管将在同一时间完成孵育；
(4)        用大量盐水立刻洗涤红细胞3次,得压积酶处理红细胞，然后用盐水配制成2～5%的悬液待用；
(5)        标记四支试管：未处理，5分钟，10分钟，15分钟；
(6)        在四支试管中各加入2滴血清；
(7)        在标记好的试管中各加入1滴红细胞悬液,混匀，37℃孵育15分钟；
(8)        离心，轻轻地重悬细胞扣检查凝集；
(9)        用盐水洗涤细胞3或4次，进行间接抗人球蛋白试验；
(10)        结果判读，记录并解释。
以下显示假设的D阳性，Fya阳性细胞与酶反应的结果
酶处理细胞        条件或介质        AB血清        抗D        抗Fya
未处理        37℃        0        0        0
        AGT        0        +        3+
5分钟        37℃        0        +        0
        AGT        0        2+        1+
10分钟        37℃        0        2+        0
        AGT        0        2+        0
15分钟        37℃        0        2+        0
        AGT        +w        2+        +w
最佳孵育时间可能为10分钟。只孵育5分钟时酶处理不彻底或抗D活性没有提到最高；孵育15分钟，会引起免疫学上假阳性的反应：AB血清会产生抗人球蛋白假阳性反应。假如孵育5分钟证明细胞处理过度，则使用较稀的酶应用液比减少孵育时间要好。因为难以准确地把握短的孵育时间。追加试剂时可以选择单一稀释度来研究不同孵育时间的影响，也可以选择单一孵育时间来研究不同稀释度的影响。
5.1.2.5.4.4  评估处理的红细胞
(1)        在使用处理过的红细胞之前，需要证明这种酶处理是合适的而不是过度的。假如细胞能和只与未处理的细胞产生抗球蛋白反应的抗体发生凝集则证明处理是适宜的。
(2)        选择一种抗体，它与酶处理的、有相应抗原的细胞凝集，而只与未处理细胞发生抗球蛋白反应。许多患者血清中的抗D抗体是以这种方式表现的；
(3)        通常在1支标记为"阳性"的试管内加入2滴含抗体的血清；在另1支标记为"阴性"的试管内加入2滴不含抗体的血清；
(4)        向二支试管中各加1滴2％酶处理的细胞悬液,混合，并在37℃孵育15分钟；
(5)        离心，轻轻将细胞悬浮;在显微镜下检查凝集：在"阳性"管内应该有凝集而在"阴性"管内不应该有凝集，如在"阴性"管内发生凝集，则细胞处理过度，如在"阳性"管内不发生凝集则处理是不适宜的。
5.1.2.5.4.5  酶的一步法
(1)        取受检者血清2滴置于试管中；
(2)        加入1滴2～5%试剂红细胞悬液；
(3)        加入2滴无花果酶溶液，混匀, 37℃孵育30分钟；
(4)        离心，将细胞轻轻重新悬浮，并观察凝集反应，记录结果；
(5)        如需要可进一步作抗球蛋白试验。
5.1.2.5.4.6  酶的二步法
(1)        在1ml 1%无花果蛋白酶溶液中加入9mlpH7.3的PBS来配制0.1%无花果蛋白酶溶液；
(2)        在1份洗涤过的压积红细胞中加入1份0.1%无花果蛋白酶溶液；
(3)        在37℃孵育15～30分钟(时间是经过测定对此酶溶液是最适宜的，参见酶的标准化)；
(4)        用大量盐水将处理的红细胞至少洗3次，用盐水将细胞配成2～5％的悬液；
(5)        在标记好的试管内加入2滴血清；
(6)        加1滴2.5%酶处理的红细胞悬液；
(7)        混合，37℃孵育30分钟；离心，轻轻悬浮红细胞，观察凝集反应；
(8)        如需要可进一步做抗球蛋白试验；
血清学实验中常用的酶制剂
无花果蛋白酶(巯基内切蛋白酶)        胰蛋白酶(丝氨酸蛋白内切酶)        胰凝乳蛋白酶(丝氨酸蛋白内切酶)
木瓜酶/DTT(称ZZAP)        菠萝酶        链霉蛋白酶
5.1.2.5.4.7  酶制剂对抗原的影响
(1)        尽管酶可能除去抗原的一部分，但一些以碳水化合物形式存在的抗原(ABO，P1，Lewis，H，I，Sta等)，经酶处理后的凝集强度不变或是增强。这同样也适用于特异性代表抗原(Rh，Kidd，Diego，Kx，℃lton)。
(2)        酶同样也能破坏或降低抗原活性，对于这类抗原可选用抗人球蛋白技术检测抗体，此外还需注意，与处理红细胞反应的血清中可能还含有另外一种抗体。
5.1.2.5.4.8  酶处理红细胞凝集素：
有些抗体可与酶处理红细胞发生特异性反应，能和酶处理的红细胞发生凝集，但不与未经酶处理的细胞起反应，其原因尚不完全清楚，可能是酶处理后某些抗原部位得以暴露，不同的酶可使红细胞暴露不同的部位，对于这类与酶处理红细胞才发生凝集的抗体可称为酶处理红细胞凝集素，它有以下几个特点：1)抗球蛋白试验阴性或反应微弱；2)常表现为自身凝集或全凝集；3)可以和其他的酶处理细胞发生交叉反应，也可能不发生交叉反应；4)偶尔有型特异性；5)也可能表现为同种异体抗体特异性；6)一些Rh系统的抗体，尤其是抗E和抗C与木瓜酶处理的细胞反应强；7)通常不引起输血反应。
5.1.2.6  抗体效价与同种及自身抗体的检测
5.1.2.6.1  抗体效价滴定
【原理】
血清经连续倍比稀释后与选定的红细胞进行反应，通常以肉眼可见的明显凝集的最高血清稀释度数值的倒数来表示效价，这个半定量的方法能提供血清中抗体的量或红细胞上抗原的量的情况，常用于产前检查和抗体特异性鉴定，当使用不稀释的血清时，某些抗体能引起普遍的凝集，比较效价滴定结果，就可以显示其特异性。
【材料】
移液管；待滴定血清； 2～5%表达某些抗原的红细胞悬液(红细胞悬液的的一致性对确保结果的可比性非常重要)。
【方法】
(1)        按照血清稀释度标记一组试管(如1：1，1：2，1：4…)，1：1是一个体积的未稀释血清，1：2是一个体积的血清加一个体积的稀释液或者说稀释液中血清的体积所占比例为50%；
(2)        除第1管(1：1)外其他试管都加1份盐水；
(3)        在第1和2个试管中各加1份血清,第2管混均后移出1份容量至后1管(1：4)；
(4)        用相同方法继续稀释，从最后一个试管中取出1份容量保留备用；
(5)        标记10个12*75mm试管,对每一个稀释度的血清用1支滴管滴2滴在标记的试管中,混均，并用适当的技术来检查；
(6)        离心后，肉眼观察试验结果。
【结果判读】
(1)        肉眼观察凝集为1+的最高稀释度，则该稀释度即为试验结果。如果最高稀释的血清仍有强于1+的凝集，则未达到终点，须要做额外稀释和试验。
(2)        在比较研究中，效价至少有三个或以上不同稀释度差异才能算有意义。技术上的不同或固有的变异性可能使同一个血清标本产生一个稀释度的差异。
(3)        不考虑凝集强度，仅考虑效价能使人误解，根据对每个标本在不同稀释度中观察的凝集反应强度，指定一个数字来表示滴定结果之间的差异，把这些数字加起来就是效价评分，是抗体反应性强度的半定量估计，总评分相差10或以上就认为反应性的差别有意义。
凝集强度        效价评分
4+        12
3+        10
2+        8
1+        5
W+        2
0        0
【注意事项】
(1)        注意吸管是最基本的，每个稀释可以不更换吸管。
(2)        孵育的最佳时间及温度和离心时间、离心力必须一致。
(3)        试剂细胞的表型，浓度，生产日期将会影响结果。
(4)        效价和评分有时也用来评价抗原的抗原性强弱和不同实验方法的差异。
(5)        前带现象可以引起前几管高浓度管中的反应比稀释度更高的反应弱。
5.1.2.6.2  用巯基试剂区分IgM抗体和IgG抗体
【原理】
有些血型抗体（如抗-A）在一个体中可有二种存在形式，有IgG也有IgM。IgM分子由5个轴射状排列的亚单位组成，亚基间以二硫键相连，亚基间的二硫键比亚基内链间与链内二硫键容易被巯基试剂破坏，经巯基试剂处理后，IgM失去原来的血清学性质，常用的巯基试剂有二硫苏糖醇(dithiothretol，DTT)和2-甲基巯基乙醇(2-meicaploethanol，2-Me)。
【试剂】
pH7.3 PBS；0.01M DTT:0.154g DTT溶解于pH7.3PBS至100ml，2～8℃保存；待测血清2ml。

秋天de小志

【方法】
(1)        在两个试管中分别加入待测血清1ml；
(2)        一个试管标记对照管，加1ml pH 7.3 PBS;另一个试管加入1ml 0.01M DDT；
(3)        混均，37℃孵育30～60分钟；
(4)        取实验用量加相应红细胞悬液，用间接抗人球蛋白试验方法与一般测效价相同，必须注意的是血清+DTT处理时已是1：2稀释了，计算效价时要加一个稀释度。
【注意事项】
(1)        本实验中也可使用2-Me处理血清。
(2)        如果对照管未见反应，表示抗体被稀释，结果不可信。
5.1.2.6.3  同种抗体鉴定
【原理】
同种抗体的鉴定广泛用于输血反应的诊断与预防和新生儿溶血病的诊断等方面。IgM分子量较大在介质中能直接相连相应的红细胞，使之发生肉眼可见的凝集，IgG在盐水中不凝集而只能致敏相应的抗原的红细胞，必须通过其他介质，酶法，低离子强度溶液法，抗人球蛋白法，聚凝胺法，凝胶法等血清学技术才能检出。
【试剂】
抗人球蛋白试剂；试剂红细胞。
【方法】
间接抗球蛋白试验
(1)        取受检者血清2滴，加2～3%试剂红细胞1滴，37℃水浴30～60分钟；
(2)        离心，观察溶血和凝集；
(3)        用生理盐水洗涤3次,最后一次洗涤后弃去全部盐水，将试管边缘盐水用滤纸吸干；
(4)        加1滴抗人球蛋白试剂，混合；
(5)        离心，轻轻悬浮细胞，观察结果；
(6)        如结果阴性，加IgG致敏红细胞1滴，离心并观察结果，如不凝集表示试剂无效，试验不可靠，必须重做。
【注意事项】
(1)        试验中，一般需使用10个(或以上)细胞组成的细胞谱。
(2)        根据需要选择吸收、放散试验。
(3)        阴性试验不一定意味着血清中不存在抗体，而只是说明在使用这些技术时，缺乏与鉴定细胞起反应的抗体。
(4)        抗体鉴定时，操作人员要进行综合判断以下可能对实验产生影响的因素，如反应温度：低温性，37℃反应性；媒介物：盐水不凝集，用酶增强；酶法不凝集，用抗人球蛋白增强；细胞反应格局分析；血型物质的抑制，如人的唾液：抗Le(a)、人的尿液：抗Sd(a)、人的血浆：抗Ch、以及其他的血型物质：抗P1；自身抗体的否定：直接抗球蛋白试验阴性；药物引起的抗体：用药史；抗体的吸收，放散试验：复合或混合抗体。
5.1.2.6.4  自身抗体鉴定
5.1.2.6.4.1  冷自身抗体
1)        冷自身抗体的吸收
虽然大多数冷自身抗体并不影响血清学试验，但有些情况下冷自身抗体的存在会掩盖同时存在的有临床意义的同种抗体。因此用自身红细胞在冷的实验条件下吸收血清去除自身抗体，以检测潜在的同种抗体。对大多数非病理性的自身冷抗体，简单的采用酶处理的红细胞吸收受检血清即可去除大多数冷抗体，而更为有效的去除方法是使用ZZAP试剂。
含有冷自身抗体的标本采集：采1份抗凝标本，置37℃孵育防止冷抗体吸收到红细胞上，采另1份不抗凝标本置4℃，让红细胞充分吸收冷自身抗体，以后立即分离血清。
【方法】
(1)        将温育10分钟以上的抗凝血样，用37℃生理盐水洗涤3次，分置3个试管中，每管约1ml红细胞，将2ml待检血清加入其中1管混均，置4℃孵育30～60分钟，其间摇动数次，使其充分吸收，若吸收不完全，可在第2、3管重复吸收试验。
(2)        用ZZAP试剂处理待测血清：ZZAP试剂的配制：取0.2mol/L二硫苏糖醇溶液 2.5ml加0.5ml1%半胱氨酸活化木瓜酶溶液，再加2ml pH7.3PBS；在2管各有1ml压积红细胞的试管中，分别加入2ml ZZAP试剂，37℃孵育3分钟。用盐水将细胞洗涤3次，末次离心至少5分钟，并尽可能吸净上清液。在1管处理过的红细胞试管中加入2ml检测血清，4℃孵育30～40分钟，离心2分钟，将血清转入另一管处理好的红细胞试管中，重复一次。
(3)        吸收以后的血清用来检测同种抗体。
2)        冷自身抗体特异性的测定
(1)        将血清或血浆用盐水倍量稀释从1：2～1：4096(12管)，稀释体积不应少于1ml；
(2)        每个稀释度取3滴样品加1滴5%试验所需的红细胞悬液，混均；
(3)        室温孵育15分钟，离心，肉眼观察凝集；
(4)        将试管移至4℃，孵育1小时，离心，肉眼观察凝集；
(5)        结果判读，并记录、解释。
表5.1.3  列举了冷自身抗体常见的反应
表 5.1.3  显示由冷凝集素定义的抗原对应的抗体分别和成人(Ad)、脐带(Cd)、成人i(iad)、木瓜酶(Pap)处理和唾液酸酶处理(Sial)红细胞反应的结果。
抗原        Ad        Cd        iad        Pap        Sia        注释
I        +        W        W        +        +        支链糖蛋白和糖脂
i        W        +        +        +        +        直链糖蛋白和糖脂
IT        W        +        W        +        +       
j        +        +        +        +        +        直链和支链糖蛋白和糖脂
Pr1-3        +        +        +        0        0        O型糖基化糖蛋白
Pra        +        +        +        0        +       
Sa        +        +        +        W        0        O型糖基化糖蛋白和神经节苷脂
Sia-Ib1(Gd1)        +        +        +        +        0        唾液酸化直链和支链糖脂
Sia-Ib2(Gd2)        +        +        +        +        0        唾液酸化直链和支链糖脂
Sia-b1(Fl)        +        W        W        +        0        唾液酸化支链糖脂
Sia-I1(Vo)        W        +        +        +        W        唾液酸化直链糖脂
Li        W        +        +        +        0        唾液酸化直链糖脂
Lud        +        W        +        W        0       
Me        +        +                +        +        被人乳增强凝集
Om        +        +                +        +        不被人乳增强凝集
Ju        +        +                W        W       
IgMWOO        0        0        0        0        +        1型链
Rx        +        w        +        +        +        最适pH 6.5; 旧名Sdx
+，强凝集；w，相对＋较弱的凝集；0,不凝集。
【注意事项】
与冷凝集素综合征有关的最常见的特异性抗体是抗I，但有时也见抗Pr。有些抗I与H抗原强的细胞(O，A2细胞)反应也强，这样的抗体称为抗IH，酶处理的细胞都能增强这些抗体的反应，而抗Pr反应减弱，抗Pr与未处理的I或I细胞反应相同，如果成人细胞和脐带血细胞在酶处理后出现弱的多的反应，首先要考虑抗Pr。
3)        冷自身抗体效价的测定
【试剂】
血清：37℃采集，37℃分离 ；1% O型I阳性红细胞悬液； pH7.3 PBS。
【方法】
(1)        将血清1：5稀释，再将血清倍量稀释从1：2～1：4096(12管)；
(2)        每个试管加0.5ml1%O型I阳性红细胞悬液，混匀，4℃孵育1-2小时；
(3)        900～1000g离心15秒，肉眼检查凝集，判读并记录结果。
【注意事项】
(1)        在进行稀释时，每个稀释度要更换吸管，如果整个过程只用一支吸管，会得到假的高效价结果；
(2)        每个稀释管中的盐水应使用较大的量(如0.5ml)，比小体积稀释更精确。
5.1.2.6.4.2温自身抗体的吸收
有温自身抗体的患者循环中的红细胞包被着自身抗体，血清中也可能还有这种游离抗体。首先需去除红细胞上包被的自身抗体，再用细胞去吸收血清中的温自身抗体，预先用蛋白水解酶处理的细胞常可改善对抗体的吸收，并减少需要吸收的次数。
【方法】
(1)        将患者的红细胞用温(37℃)生理盐水洗涤3次，900～1000g离心2分钟去上清液；
(2)        取1ml压积红细胞加ZZAP试剂1ml37℃孵育30分钟，孵育期间定期将标本混匀几次；
(3)        洗涤处理红细胞3次，900～1000g离心2分钟，最后一次洗涤后要尽量吸净上清液，得压积红细胞；
(4)        取压积ZZAP试剂处理的自身红细胞1份加患者血清1份，混匀，37℃孵育30分钟,900～1000g离心2分钟；
(5)        吸收以后的血清用来检测同种抗体。
5.1.2.7  放散
放散就是从红细胞上把抗体解离下来，从红细胞上去除抗体的方法就是放散试验，它可用于ABO亚型的鉴定，新生儿溶血病的诊断和自身免疫性溶血性贫血患者红细胞的抗体特异性的鉴定，以及吸收后把抗体再放散下来进行鉴定，或制备单特异性抗体。
5.1.2.7.1  热放散法
(1)        取1份洗涤过的压积细胞，加1份盐水(或AB血清或6%白蛋白)；
(2)        混匀，56℃水浴中放置约10分钟，并不断摇动；
(3)        1000g离心2分钟，如果可能，则使用预加热过的离心杯；
(4)        立即分离上清液。
【注意】
放散时应严格注意温度和时间，温度过高，细胞易溶解，温度过低抗体从红细胞上放散不完全。
5.1.2.7.2  乙醚放散
(1)        1份洗涤过的压积红细胞加1份盐水和2份乙醚；
(2)        用塞子塞紧试管口，用力震动1分钟，取下塞子数次，以便排出挥发性乙醚；
(3)        1000g离心10分钟，离心后即分成3层，最上层是乙醚，中层是红细胞基质，下层是有抗体的放散液，将醚层取出并丢弃水溶性上清液，基层深红；
(4)        打开塞子，在56℃加热以便将乙醚彻底去除，当乙醚蒸发时应防止放散液溢出；
(5)        1000g离心5分钟，将含有血红蛋白的水溶液吸出并贮存。
【注意事项】
(1)        乙醚放散液最好用在抗球蛋白技术中，否则检查凝集反应会因红细胞的凝集与暗红色的放散液颜色相似而使盐水、酶介质反应的结果判读发生困难。
(2)        剩余的醚会使检验用的细胞发生溶解，如果放散液中还残存少量的醚，则在加红细胞之前，可以把含2滴放散液的试管放在37℃水浴中孵育5分钟。
(3)        乙醚放散法，主要用于红细胞上的各种IgG抗体的检测。
5.1.2.7.3  磷酸氯喹法
当红细胞包被IgG抗体，直接抗球蛋白试验阳性时，不能用酶法或抗球蛋白试验作血型鉴定，例如抗Fy(a)。使用二磷酸氯喹可以分离红细胞上的IgG，并能同时保持红细胞膜的完整性和抗原的活性。
【试剂】
磷酸氯喹溶液的配制：20g二磷酸氯喹溶于100ml盐水中，用1mol/L NaOH调至pH5.1，2～6℃保存；IgG致敏的直接抗球蛋白试验阳性的试剂红细胞；含有已知抗原的对照红细胞，以证实在处理过程中未丢失抗原
【方法】
(1)        取0.2ml洗涤压积红细胞加0.8ml二磷酸氯喹溶液，同样处理对照细胞；
(2)        混匀，置室温孵育30分钟；
(3)        取1滴红细胞悬液用盐水洗涤4次；
(4)        用抗IgG检测洗涤红细胞；
(5)        若与抗IgG不凝集，可洗涤全部处理的红细胞作试验用；
(6)        若仍与抗IgG有反应，要重复孵育和检测，但总的孵育时间不要超过2小时。
【注意事项】
(1)        此方法不能将蛋白从细胞膜上完全分离，如果细胞被IgG和补体包被氯喹处理后只能用于测定抗IgG。
(2)        孵育应不要超过2小时，延长室温孵育时间或在37℃孵育可能引起溶血或红细胞抗原的丢失。
(3)        可能发生Rh抗原变性作用，当红细胞孵育后发生溶血或有盐水反应或使用化学修饰的抗Rh试剂时，这种情况最要引起注意。做磷酸氯喹处理的红细胞试验应该使用高蛋白试剂，并做对照。
(4)        当磷酸氯喹处理的红细胞用于抗原定型，但不是Rh系统时，应该有平行对照试验。例如6％牛白蛋白。
(5)        此方法不能完全从致敏红细胞上去除抗体，DAT阳性的结果(特别是最初试验DAT阳性，放散后实验结果)可能仅仅是强度减弱而已。
(6)        另外可用于除去自身抗体，此方法可以从红细胞去除Bg(HLA)相关抗原。
5.1.2.7.4  冷酸放散
【试剂】
甘氨酸-HCl(0.1M pH3.0)：取3.75g甘氨酸和2.922g氯化钠，用蒸馏水稀释至500ml，用12N HCl调至pH3.0，2-8℃保存；磷酸缓冲液(0.8M pH8.2)：取109.6g Na2HPO4和3.8g KH2PO4加600ml蒸馏水，用1N NaOH和1N HCl校正pH，最终稀释至1000ml，4℃保存；生理盐水，2-8℃保存；已用盐水洗涤6次的DAT阳性压积红细胞；最终洗涤上清液。
【方法】
(1)        将洗涤的压积红细胞冰浴5分钟；
(2)        加1ml冷盐水和2ml冷的甘氨酸-HCl到1ml洗涤红细胞中，混匀，试管冰浴1分钟，900～1000g离心2～3分钟；
(3)        将上述放散液移入一个干净试管中，每毫升放散液加0.1ml pH8.2磷酸缓冲液；
(4)        混匀，900～1000g离心2～3分钟；
(5)        将上清放散液放入干净试管，与最终洗涤上清液一起进行平行试验。
【注意事项】
(1)        本实验过程中的甘氨酸应保持在冰浴条件下，以维持正确的PH。
(2)        磷酸缓冲液应预先保存在2-8℃，使用前应平衡至37℃。
(3)        加入磷酸缓冲液使酸性放散液恢复成中性。酸性放散液可造成试剂红细胞溶血，此时加入22％的白蛋白与放散液1：4混合，可减少这种溶血。


5.2  HLA血型检测
HLA是人类组织相容性抗原，与移植免疫密切相关。准确的HLA分型对临床进行造血干细胞移植和器官移植患者的组织配型、骨髓库的建立与发展、免疫性疾病的研究等具有重要意义。其检测技术经历了二个阶段-血清学分型阶段和DNA基因分型阶段。
5.2.1  HLA血型检测基本要求
5.2.1.1  实验中所涉及的仪器设备在正确安装后，需校正后方可使用。
5.2.1.2  每批HLA基因分型试剂在使用前须用质控DNA来验证其特异性、准确性及重复性。
5.2.1.3  每次分型实验均应设立阴、阳对照。
5.2.1.4  对已经完成的检测标本须按一定比例抽检，采用不同的分型试剂复检，以保证样本检测的准确性。
5.2.1.5  HLA基因分型操作的全过程应严格遵守防污染的规章制度；要有监控污染的措施。
5.2.1.6  每份检测结果的实验记录及检测样本都必须具有可追溯性。
5.2.1.7  发往临床的报告应包括受检者姓名或样品编号、送检医院、送检要求、采样日期、样品状态、分型方法、分型结果、检测日期、检测者签名、复核者签名等内容。报告应一式两份。
5.2.1.8  开展常规HLA基因分型检测工作的实验室至少应参加国家级的HLA基因分型室间质量评价。
5.2.2  HLA血清学技术操作规程
5.2.2.1  密度梯度离心法从外周全血中分离混合淋巴细胞
淋巴细胞的分离方法有多种，包括密度梯度离心法、B淋巴细胞分离剂法以及免疫磁珠法等。本节中仅介绍利用密度梯度离心法从外周全血中分离混合淋巴细胞。
5.2.2.1.1  适用范围
为HLA-Ⅰ、Ⅱ类血清学分型、供/受者交叉淋巴细胞毒试验提供高纯度的淋巴细胞。
5.2.2.1.2  原理
不同的细胞有不同的沉降速度，利用这一特性，进行细胞分离。将ACD或玻璃珠去纤抗凝稀释血置于比重为1.076±0.001 的淋巴细胞分离液上，通过离心使比重大于分离液的红细胞、多核细胞等沉到分离液的底层，血小板存在于上层血浆中，而淋巴细胞则浮悬于血浆和分离液的界面层中。
5.2.2.1.3  材料与试剂
· 淋巴细胞分离液；
· 抗凝剂：如枸椽酸盐抗凝剂（ACD）、肝素等；
· 生理盐水或其它平衡盐溶液（磷酸盐缓冲液PBS、Hanks液等）；
· Terasaki液或RPMI-1640组织培养液；
· 1ul、5ul连续加样器；
· 水平离心机。
5.2.2.1.4  步骤与方法
A  血样的采集与抗凝: 抽取外周静脉血3～5毫升，采用肝素抗凝或采用玻璃珠去纤抗疑,在锥形瓶中加入毛玻璃珠10～15粒，摇动锥形瓶，使玻璃珠锥形瓶壁作圆周运动（约20次/分钟），持续约5分钟，直至玻璃珠被纤维缠住。抗凝血置于室温下。
B  淋巴细胞分离液等试剂使用前要平衡至室温。
C  对血样进行稀释：每毫升肝素抗凝或玻璃珠去纤抗凝血用等体积的生理盐水或PBS缓冲液等进行稀释。
D  将上述稀释血液，沿管壁缓缓加在淋巴细胞分离液上层（稀释血与分离液之比为2：1），用水平离心机400g离心20分钟。
E  离心后，绝大多数淋巴细胞浮悬于血浆与分离液的界面层，呈白膜状。用毛细管轻轻插入白膜层,沿试管壁吸取整个界面层细胞,转移至另一干净试管中。
F  用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞,离心速度依次为1500 rpm/min离心10分钟和800 rpm/min离心8分钟。每次洗涤加入PBS前,应将试管内细胞轻轻摇匀以防结块。
G  二次洗涤后,若发现红细胞污染严重,可直接加入0.5～1.0ml 蒸馏水,处理40秒，立即加入大量的PBS，450g离心5分钟，弃上清液。
H  最后得到的压积淋巴细胞用RPMI-1640或Terasaki液，调整细胞浓度为2×106/毫升备用。
5.2.2.1.5  结果判断
淋巴细胞的纯度：应大于90%。
5.2.2.1.6  质量控制
· 肝素和淋巴细胞分离液使用前应平衡至室温，过冷将影响分离液的比重，造成红细胞污染，并且容易使血小板和淋巴细胞发生聚集。
· 整个分离过程中，应控制温度在22～25℃。
· 尽可能除去血小板，以免影响淋巴细胞毒试验结果。
5.2.2.2  微量淋巴细胞毒试验
5.2.2.2.1  适用范围
HLA-Ⅰ、Ⅱ类血清学分型、供/受者交叉淋巴细胞毒试验等。
5.2.2.2.2  原理
淋巴细胞膜表面具有HLA抗原，HLA特异性抗体与淋巴细胞膜上相应的HLA抗原结合，激活补体，从而改变了细胞膜的通透性，采用染色法着色，染料进入到细胞中；如淋巴细胞不带有相应的抗原，则细胞膜完整，染料无法进入。在显微镜下估计着色细胞的百分比来判断抗原、抗体反应的强度。
5.2.2.2.3  材料与试剂
· 72孔微量淋巴细胞毒实验反应板；
· 兔补体；
· 5%的曙红水溶液；
· 12%的甲醛溶液；
· 倒置相差显微镜 ；
· 单联1微升连续加样器；
· 六联5微升连续加样器。
5.2.2.2.4  步骤与方法
A  在72孔微量反应板中，每孔加石蜡油1滴（8 mL）。
B  每孔加血清1mL，淋巴细胞悬液1mL。
C  22±2℃下，T细胞或混合淋巴细胞孵育30～45分钟，B淋巴细胞放置60～75分钟。
D  每孔加兔补体5mL。
E  22±2℃下，T细胞或混合淋巴细胞孵育60分钟，B淋巴细胞放置120分钟。
F  每孔加入5%曙红溶液2～3mL，染色5分钟。
G  每孔加入12%的甲醛溶液8mL，固定和终止反应。
H  静止4小时以上或过夜，盖上载玻片看结果，紧急情况下可54 g离心判断结果。
5.2.2.2.5  结果判断
读板从1A→1F，然后2F→2A，依次进行，直至12A。在倒置相差显微镜下，被染色的细胞即死细胞，细胞肿胀，无折光能力，呈黑灰色；未被染色的细胞即活细胞，折光能力强，呈光亮状。以NIH方法为准，按照死细胞所占比例来判定每一孔的反应结果（见附表）。根据试剂盒所提供的反应格局表判读HLA血清学分型结果。
微量淋巴细胞毒实验结果判定
        死细胞比例        评分
阴性        1-10%        1
阴性可疑        11-20%        2
阳性可疑        21-40%        4
阳性反应        41-80%        6
强阳性反应        ＞81%        8
5.2.2.2.6  质量控制
·每块反应板应设立阴性对照（阴性对照血清一般采有AB型男性、无受血史者血清）和阳性对照（阳性对照孔中加入了抗淋巴细胞球蛋白），在阴性对照结果为阴性、阳性对照结果为阳性反应时，判读结果。
·兔补体（兔血清）中无天然细胞毒抗体，不引起假阳性反应用。
·石蜡油无毒性。
·为避免每孔细胞不均匀，可用软加法，先将加样器吸一点空气，然后再吸取细胞或试剂。
5.2.2.3  HLA抗体筛选
与移植排斥反应相关的HLA-Ⅰ、Ⅱ类 IgG抗体筛选技术，包括补体依赖淋巴细胞毒方法（CDC）、抗人球蛋白-补体依赖淋巴细胞毒方法（AHG-CDC）、流式细胞仪方法（FCXM）、免疫磁珠方法以及酶联免疫吸附测定方法（ELISA）等，本章节中介绍CDC及ELISA方法。
5.2.2.3.1  适用范围
患者血清中HLA抗体的筛选。
5.2.2.3.2  原理
·补体依赖淋巴细胞毒方法（CDC）：受检者血清中的抗体与供者淋巴细胞表面的HLA抗原相给合后，激活补体，引起供者淋巴细胞细胞膜被破坏，这种抗体称细胞毒抗体。将含有此抗体的血清与供者淋巴细胞、补体共同孵育，淋巴细胞膜被破坏、通透性增加，染料得以渗入，使细胞着色。根据着色的死细胞数量，来估计淋巴细胞细毒的强度。
·酶联免疫吸附测定方法（ELISA）：抗HLA-Ⅰ或Ⅱ类单克隆抗体（抗α-3）包被酶联板孔，并捕获可溶性HLA抗原，从而制成ELISA试剂板。当受检者血清样本中存在抗HLA-IgG抗体时，发生抗原-抗体特异性反应，加入抗人IgG酶联交联剂，发生酶促显色反应。从而检测出样本中是否存在HLA IgG抗体。
5.2.2.3.3  材料与试剂
·补体依赖淋巴细胞毒方法（CDC）：
72孔微量淋巴细胞毒实验反应板；
兔补体；
5%的曙红水溶液；
12%的甲醛溶液；
倒置相差显微镜 ；
单联1微升连续加样器；
六联5微升连续加样器。
·酶联免疫吸附测定方法（ELISA）：见各类商品化试剂盒
5.2.2.3.4  步骤与方法
·补体依赖淋巴细胞毒方法（CDC）：
A  按常规法使用淋巴细胞分离液，分离计划供者的淋巴细胞，并调节2000个/mL。
B  在72孔微量反应板中，每孔加石蜡油1滴（8 mL）。
C  每孔加受检者血清1mL，计划供者淋巴细胞悬液1mL。
D  37℃下，T细胞或混合淋巴细胞孵育30分钟。
E  每孔加兔补体5mL。
F  37℃下，孵育60分钟。
G  每孔加入5%曙红溶液2～3mL，染色5分钟。
H  每孔加入12%的甲醛溶液8 mL。
I  静止或54g离心后在倒置相差显微镜下判断结果。
·酶联免疫吸附测定方法（ELISA）：按试剂盒说明书操作。
5.2.2.3.5  结果判断
·补体依赖淋巴细胞毒方法中，阳性对照中死亡细胞数大于90%，阴性对照死亡细胞数小于2%，表明试验结果可靠。临床一般将细胞毒低于10%作为阴性，大于10%作为移植禁忌。
·酶联免疫吸附测定方法（ELISA）中，应用酶标仪读板。若无酶标分析仪，根据阴性和阳性对照颜色之深浅，观察检测血清的结果；阳性孔为蓝色，阴性孔为无色。
5.2.2.3.6  质量控制
·设立阴性对照和阳性对照。
·加样时，注意避免交叉污染。
5.2.3  HLA基因分型技术操作规程  
5.2.3.1  DNA的提取
DNA提取方法总的原则是应保证DNA一级结构的完整性，同时应排除其它分子的污染。其主要步骤是破碎细胞，去除与DNA结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀DNA，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。
提取DNA若采用商品化试剂盒，操作应按试剂盒说明书进行。在这里仅介绍酚氯仿抽提DNA的方法。
5.2.3.1.1  酚氯仿抽提DNA的原理
DNA以核蛋白的形式存在于细胞核中，它是由4种DNA单体以磷酸二酯键连接而成的长链分子。血细胞破碎后，从核酸样品中去除蛋白质时使用平衡酚和氯仿：异戊醇（24：1）,其中酚能有效地使蛋白质变性，氯仿亦可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离，异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的泡沫。先用酚：氯仿然后再用氯仿抽提，使用两种不同的有机溶剂比用单一有机溶剂效果更佳，而且氯仿抽提可去除残留的痕量酚。然后采用无水乙醇沉淀DNA。
5.2.3.1.2  设备与材料
超净工作台、不同量程的加样器、离心机、混匀器、加热混合器、分光光度计。Tip头、1.5ml Eppendorf管、比色杯。
5.2.3.1.3  试剂
·5% EDTA-Na2·2H2O（pH8.0）:在800ml水中加入50g EDTA-Na2·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0（约需6gNaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
·红细胞裂解液（RCLB）：
蔗糖                        34.24g
1mol/L Tris-HCL(pH7.6)         1ml
1mol/L MgCl2·6H2O            0.5ml
10%  Triton X-100              1ml
dH2O加至100 ml，4℃保存
o白细胞裂解液（WCLB）：
1mol/L Tris-HCL(pH7.6)         1ml
0.5mol/L EDTA(pH8.0)           2ml
NaCl2                       0.292g
dH2O加至100 ml
·DSP储存液
1mol/L Tris-HCL(pH8.0)          1ml
1mol/L KCL                    2.5ml
1mol/L MgCl2·6H2O           0.125ml
dH2O加至50 ml，高压消毒后储于室温。
o DSP工作液(临用前配制)
DSP储存液                     915ml
蛋白酶K（10mg/ml）             80ml
Tween 20                         5ml
o 氯仿：异戊醇（24：1）
o PCL（酚-氯仿-异戊醇）的配制（100ml）：75 ml酚+25 ml氯仿：异戊醇（24：1）；加入15ml的1mol/L Tris-HCL(pH8.0)，混匀；放置至酚层澄清透明；弃去上层液相；加入15ml的0.1mol/L Tris-HCL(pH8.0)，并加入8-羟基喹啉至终浓度为0.1%，充分混匀；放置至酚层澄清透明；弃去上层液相；加入10 ml左右0.1mol/L Tris-HCL(pH8.0)于液面上。将此混合液存放在不透光的试剂瓶中，可于4℃保存1个月。
o 无水乙醇
o 70%乙醇
o TE缓冲液（pH8.0）
1mol/L Tris-HCL(pH8.0)         2.5ml
0.5mol/L EDTA(pH 8.0)          0.5ml
dH2O加至250 ml

秋天de小志

【方法】
(1)        在两个试管中分别加入待测血清1ml；
(2)        一个试管标记对照管，加1ml pH 7.3 PBS;另一个试管加入1ml 0.01M DDT；
(3)        混均，37℃孵育30～60分钟；
(4)        取实验用量加相应红细胞悬液，用间接抗人球蛋白试验方法与一般测效价相同，必须注意的是血清+DTT处理时已是1：2稀释了，计算效价时要加一个稀释度。
【注意事项】
(1)        本实验中也可使用2-Me处理血清。
(2)        如果对照管未见反应，表示抗体被稀释，结果不可信。
5.1.2.6.3  同种抗体鉴定
【原理】
同种抗体的鉴定广泛用于输血反应的诊断与预防和新生儿溶血病的诊断等方面。IgM分子量较大在介质中能直接相连相应的红细胞，使之发生肉眼可见的凝集，IgG在盐水中不凝集而只能致敏相应的抗原的红细胞，必须通过其他介质，酶法，低离子强度溶液法，抗人球蛋白法，聚凝胺法，凝胶法等血清学技术才能检出。
【试剂】
抗人球蛋白试剂；试剂红细胞。
【方法】
间接抗球蛋白试验
(1)        取受检者血清2滴，加2～3%试剂红细胞1滴，37℃水浴30～60分钟；
(2)        离心，观察溶血和凝集；
(3)        用生理盐水洗涤3次,最后一次洗涤后弃去全部盐水，将试管边缘盐水用滤纸吸干；
(4)        加1滴抗人球蛋白试剂，混合；
(5)        离心，轻轻悬浮细胞，观察结果；
(6)        如结果阴性，加IgG致敏红细胞1滴，离心并观察结果，如不凝集表示试剂无效，试验不可靠，必须重做。
【注意事项】
(1)        试验中，一般需使用10个(或以上)细胞组成的细胞谱。
(2)        根据需要选择吸收、放散试验。
(3)        阴性试验不一定意味着血清中不存在抗体，而只是说明在使用这些技术时，缺乏与鉴定细胞起反应的抗体。
(4)        抗体鉴定时，操作人员要进行综合判断以下可能对实验产生影响的因素，如反应温度：低温性，37℃反应性；媒介物：盐水不凝集，用酶增强；酶法不凝集，用抗人球蛋白增强；细胞反应格局分析；血型物质的抑制，如人的唾液：抗Le(a)、人的尿液：抗Sd(a)、人的血浆：抗Ch、以及其他的血型物质：抗P1；自身抗体的否定：直接抗球蛋白试验阴性；药物引起的抗体：用药史；抗体的吸收，放散试验：复合或混合抗体。
5.1.2.6.4  自身抗体鉴定
5.1.2.6.4.1  冷自身抗体
1)        冷自身抗体的吸收
虽然大多数冷自身抗体并不影响血清学试验，但有些情况下冷自身抗体的存在会掩盖同时存在的有临床意义的同种抗体。因此用自身红细胞在冷的实验条件下吸收血清去除自身抗体，以检测潜在的同种抗体。对大多数非病理性的自身冷抗体，简单的采用酶处理的红细胞吸收受检血清即可去除大多数冷抗体，而更为有效的去除方法是使用ZZAP试剂。
含有冷自身抗体的标本采集：采1份抗凝标本，置37℃孵育防止冷抗体吸收到红细胞上，采另1份不抗凝标本置4℃，让红细胞充分吸收冷自身抗体，以后立即分离血清。
【方法】
(1)        将温育10分钟以上的抗凝血样，用37℃生理盐水洗涤3次，分置3个试管中，每管约1ml红细胞，将2ml待检血清加入其中1管混均，置4℃孵育30～60分钟，其间摇动数次，使其充分吸收，若吸收不完全，可在第2、3管重复吸收试验。
(2)        用ZZAP试剂处理待测血清：ZZAP试剂的配制：取0.2mol/L二硫苏糖醇溶液 2.5ml加0.5ml1%半胱氨酸活化木瓜酶溶液，再加2ml pH7.3PBS；在2管各有1ml压积红细胞的试管中，分别加入2ml ZZAP试剂，37℃孵育3分钟。用盐水将细胞洗涤3次，末次离心至少5分钟，并尽可能吸净上清液。在1管处理过的红细胞试管中加入2ml检测血清，4℃孵育30～40分钟，离心2分钟，将血清转入另一管处理好的红细胞试管中，重复一次。
(3)        吸收以后的血清用来检测同种抗体。
2)        冷自身抗体特异性的测定
(1)        将血清或血浆用盐水倍量稀释从1：2～1：4096(12管)，稀释体积不应少于1ml；
(2)        每个稀释度取3滴样品加1滴5%试验所需的红细胞悬液，混均；
(3)        室温孵育15分钟，离心，肉眼观察凝集；
(4)        将试管移至4℃，孵育1小时，离心，肉眼观察凝集；
(5)        结果判读，并记录、解释。
表5.1.3  列举了冷自身抗体常见的反应
表 5.1.3  显示由冷凝集素定义的抗原对应的抗体分别和成人(Ad)、脐带(Cd)、成人i(iad)、木瓜酶(Pap)处理和唾液酸酶处理(Sial)红细胞反应的结果。
抗原        Ad        Cd        iad        Pap        Sia        注释
I        +        W        W        +        +        支链糖蛋白和糖脂
i        W        +        +        +        +        直链糖蛋白和糖脂
IT        W        +        W        +        +       
j        +        +        +        +        +        直链和支链糖蛋白和糖脂
Pr1-3        +        +        +        0        0        O型糖基化糖蛋白
Pra        +        +        +        0        +       
Sa        +        +        +        W        0        O型糖基化糖蛋白和神经节苷脂
Sia-Ib1(Gd1)        +        +        +        +        0        唾液酸化直链和支链糖脂
Sia-Ib2(Gd2)        +        +        +        +        0        唾液酸化直链和支链糖脂
Sia-b1(Fl)        +        W        W        +        0        唾液酸化支链糖脂
Sia-I1(Vo)        W        +        +        +        W        唾液酸化直链糖脂
Li        W        +        +        +        0        唾液酸化直链糖脂
Lud        +        W        +        W        0       
Me        +        +                +        +        被人乳增强凝集
Om        +        +                +        +        不被人乳增强凝集
Ju        +        +                W        W       
IgMWOO        0        0        0        0        +        1型链
Rx        +        w        +        +        +        最适pH 6.5; 旧名Sdx
+，强凝集；w，相对＋较弱的凝集；0,不凝集。
【注意事项】
与冷凝集素综合征有关的最常见的特异性抗体是抗I，但有时也见抗Pr。有些抗I与H抗原强的细胞(O，A2细胞)反应也强，这样的抗体称为抗IH，酶处理的细胞都能增强这些抗体的反应，而抗Pr反应减弱，抗Pr与未处理的I或I细胞反应相同，如果成人细胞和脐带血细胞在酶处理后出现弱的多的反应，首先要考虑抗Pr。
3)        冷自身抗体效价的测定
【试剂】
血清：37℃采集，37℃分离 ；1% O型I阳性红细胞悬液； pH7.3 PBS。
【方法】
(1)        将血清1：5稀释，再将血清倍量稀释从1：2～1：4096(12管)；
(2)        每个试管加0.5ml1%O型I阳性红细胞悬液，混匀，4℃孵育1-2小时；
(3)        900～1000g离心15秒，肉眼检查凝集，判读并记录结果。
【注意事项】
(1)        在进行稀释时，每个稀释度要更换吸管，如果整个过程只用一支吸管，会得到假的高效价结果；
(2)        每个稀释管中的盐水应使用较大的量(如0.5ml)，比小体积稀释更精确。
5.1.2.6.4.2温自身抗体的吸收
有温自身抗体的患者循环中的红细胞包被着自身抗体，血清中也可能还有这种游离抗体。首先需去除红细胞上包被的自身抗体，再用细胞去吸收血清中的温自身抗体，预先用蛋白水解酶处理的细胞常可改善对抗体的吸收，并减少需要吸收的次数。
【方法】
(1)        将患者的红细胞用温(37℃)生理盐水洗涤3次，900～1000g离心2分钟去上清液；
(2)        取1ml压积红细胞加ZZAP试剂1ml37℃孵育30分钟，孵育期间定期将标本混匀几次；
(3)        洗涤处理红细胞3次，900～1000g离心2分钟，最后一次洗涤后要尽量吸净上清液，得压积红细胞；
(4)        取压积ZZAP试剂处理的自身红细胞1份加患者血清1份，混匀，37℃孵育30分钟,900～1000g离心2分钟；
(5)        吸收以后的血清用来检测同种抗体。
5.1.2.7  放散
放散就是从红细胞上把抗体解离下来，从红细胞上去除抗体的方法就是放散试验，它可用于ABO亚型的鉴定，新生儿溶血病的诊断和自身免疫性溶血性贫血患者红细胞的抗体特异性的鉴定，以及吸收后把抗体再放散下来进行鉴定，或制备单特异性抗体。
5.1.2.7.1  热放散法
(1)        取1份洗涤过的压积细胞，加1份盐水(或AB血清或6%白蛋白)；
(2)        混匀，56℃水浴中放置约10分钟，并不断摇动；
(3)        1000g离心2分钟，如果可能，则使用预加热过的离心杯；
(4)        立即分离上清液。
【注意】
放散时应严格注意温度和时间，温度过高，细胞易溶解，温度过低抗体从红细胞上放散不完全。
5.1.2.7.2  乙醚放散
(1)        1份洗涤过的压积红细胞加1份盐水和2份乙醚；
(2)        用塞子塞紧试管口，用力震动1分钟，取下塞子数次，以便排出挥发性乙醚；
(3)        1000g离心10分钟，离心后即分成3层，最上层是乙醚，中层是红细胞基质，下层是有抗体的放散液，将醚层取出并丢弃水溶性上清液，基层深红；
(4)        打开塞子，在56℃加热以便将乙醚彻底去除，当乙醚蒸发时应防止放散液溢出；
(5)        1000g离心5分钟，将含有血红蛋白的水溶液吸出并贮存。
【注意事项】
(1)        乙醚放散液最好用在抗球蛋白技术中，否则检查凝集反应会因红细胞的凝集与暗红色的放散液颜色相似而使盐水、酶介质反应的结果判读发生困难。
(2)        剩余的醚会使检验用的细胞发生溶解，如果放散液中还残存少量的醚，则在加红细胞之前，可以把含2滴放散液的试管放在37℃水浴中孵育5分钟。
(3)        乙醚放散法，主要用于红细胞上的各种IgG抗体的检测。
5.1.2.7.3  磷酸氯喹法
当红细胞包被IgG抗体，直接抗球蛋白试验阳性时，不能用酶法或抗球蛋白试验作血型鉴定，例如抗Fy(a)。使用二磷酸氯喹可以分离红细胞上的IgG，并能同时保持红细胞膜的完整性和抗原的活性。
【试剂】
磷酸氯喹溶液的配制：20g二磷酸氯喹溶于100ml盐水中，用1mol/L NaOH调至pH5.1，2～6℃保存；IgG致敏的直接抗球蛋白试验阳性的试剂红细胞；含有已知抗原的对照红细胞，以证实在处理过程中未丢失抗原
【方法】
(1)        取0.2ml洗涤压积红细胞加0.8ml二磷酸氯喹溶液，同样处理对照细胞；
(2)        混匀，置室温孵育30分钟；
(3)        取1滴红细胞悬液用盐水洗涤4次；
(4)        用抗IgG检测洗涤红细胞；
(5)        若与抗IgG不凝集，可洗涤全部处理的红细胞作试验用；
(6)        若仍与抗IgG有反应，要重复孵育和检测，但总的孵育时间不要超过2小时。
【注意事项】
(1)        此方法不能将蛋白从细胞膜上完全分离，如果细胞被IgG和补体包被氯喹处理后只能用于测定抗IgG。
(2)        孵育应不要超过2小时，延长室温孵育时间或在37℃孵育可能引起溶血或红细胞抗原的丢失。
(3)        可能发生Rh抗原变性作用，当红细胞孵育后发生溶血或有盐水反应或使用化学修饰的抗Rh试剂时，这种情况最要引起注意。做磷酸氯喹处理的红细胞试验应该使用高蛋白试剂，并做对照。
(4)        当磷酸氯喹处理的红细胞用于抗原定型，但不是Rh系统时，应该有平行对照试验。例如6％牛白蛋白。
(5)        此方法不能完全从致敏红细胞上去除抗体，DAT阳性的结果(特别是最初试验DAT阳性，放散后实验结果)可能仅仅是强度减弱而已。
(6)        另外可用于除去自身抗体，此方法可以从红细胞去除Bg(HLA)相关抗原。
5.1.2.7.4  冷酸放散
【试剂】
甘氨酸-HCl(0.1M pH3.0)：取3.75g甘氨酸和2.922g氯化钠，用蒸馏水稀释至500ml，用12N HCl调至pH3.0，2-8℃保存；磷酸缓冲液(0.8M pH8.2)：取109.6g Na2HPO4和3.8g KH2PO4加600ml蒸馏水，用1N NaOH和1N HCl校正pH，最终稀释至1000ml，4℃保存；生理盐水，2-8℃保存；已用盐水洗涤6次的DAT阳性压积红细胞；最终洗涤上清液。
【方法】
(1)        将洗涤的压积红细胞冰浴5分钟；
(2)        加1ml冷盐水和2ml冷的甘氨酸-HCl到1ml洗涤红细胞中，混匀，试管冰浴1分钟，900～1000g离心2～3分钟；
(3)        将上述放散液移入一个干净试管中，每毫升放散液加0.1ml pH8.2磷酸缓冲液；
(4)        混匀，900～1000g离心2～3分钟；
(5)        将上清放散液放入干净试管，与最终洗涤上清液一起进行平行试验。
【注意事项】
(1)        本实验过程中的甘氨酸应保持在冰浴条件下，以维持正确的PH。
(2)        磷酸缓冲液应预先保存在2-8℃，使用前应平衡至37℃。
(3)        加入磷酸缓冲液使酸性放散液恢复成中性。酸性放散液可造成试剂红细胞溶血，此时加入22％的白蛋白与放散液1：4混合，可减少这种溶血。


5.2  HLA血型检测
HLA是人类组织相容性抗原，与移植免疫密切相关。准确的HLA分型对临床进行造血干细胞移植和器官移植患者的组织配型、骨髓库的建立与发展、免疫性疾病的研究等具有重要意义。其检测技术经历了二个阶段-血清学分型阶段和DNA基因分型阶段。
5.2.1  HLA血型检测基本要求
5.2.1.1  实验中所涉及的仪器设备在正确安装后，需校正后方可使用。
5.2.1.2  每批HLA基因分型试剂在使用前须用质控DNA来验证其特异性、准确性及重复性。
5.2.1.3  每次分型实验均应设立阴、阳对照。
5.2.1.4  对已经完成的检测标本须按一定比例抽检，采用不同的分型试剂复检，以保证样本检测的准确性。
5.2.1.5  HLA基因分型操作的全过程应严格遵守防污染的规章制度；要有监控污染的措施。
5.2.1.6  每份检测结果的实验记录及检测样本都必须具有可追溯性。
5.2.1.7  发往临床的报告应包括受检者姓名或样品编号、送检医院、送检要求、采样日期、样品状态、分型方法、分型结果、检测日期、检测者签名、复核者签名等内容。报告应一式两份。
5.2.1.8  开展常规HLA基因分型检测工作的实验室至少应参加国家级的HLA基因分型室间质量评价。
5.2.2  HLA血清学技术操作规程
5.2.2.1  密度梯度离心法从外周全血中分离混合淋巴细胞
淋巴细胞的分离方法有多种，包括密度梯度离心法、B淋巴细胞分离剂法以及免疫磁珠法等。本节中仅介绍利用密度梯度离心法从外周全血中分离混合淋巴细胞。
5.2.2.1.1  适用范围
为HLA-Ⅰ、Ⅱ类血清学分型、供/受者交叉淋巴细胞毒试验提供高纯度的淋巴细胞。
5.2.2.1.2  原理
不同的细胞有不同的沉降速度，利用这一特性，进行细胞分离。将ACD或玻璃珠去纤抗凝稀释血置于比重为1.076±0.001 的淋巴细胞分离液上，通过离心使比重大于分离液的红细胞、多核细胞等沉到分离液的底层，血小板存在于上层血浆中，而淋巴细胞则浮悬于血浆和分离液的界面层中。

秋天de小志

5.2.2.1.3  材料与试剂
· 淋巴细胞分离液；
· 抗凝剂：如枸椽酸盐抗凝剂（ACD）、肝素等；
· 生理盐水或其它平衡盐溶液（磷酸盐缓冲液PBS、Hanks液等）；
· Terasaki液或RPMI-1640组织培养液；
· 1ul、5ul连续加样器；
· 水平离心机。
5.2.2.1.4  步骤与方法
A  血样的采集与抗凝: 抽取外周静脉血3～5毫升，采用肝素抗凝或采用玻璃珠去纤抗疑,在锥形瓶中加入毛玻璃珠10～15粒，摇动锥形瓶，使玻璃珠锥形瓶壁作圆周运动（约20次/分钟），持续约5分钟，直至玻璃珠被纤维缠住。抗凝血置于室温下。
B  淋巴细胞分离液等试剂使用前要平衡至室温。
C  对血样进行稀释：每毫升肝素抗凝或玻璃珠去纤抗凝血用等体积的生理盐水或PBS缓冲液等进行稀释。
D  将上述稀释血液，沿管壁缓缓加在淋巴细胞分离液上层（稀释血与分离液之比为2：1），用水平离心机400g离心20分钟。
E  离心后，绝大多数淋巴细胞浮悬于血浆与分离液的界面层，呈白膜状。用毛细管轻轻插入白膜层,沿试管壁吸取整个界面层细胞,转移至另一干净试管中。
F  用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞,离心速度依次为1500 rpm/min离心10分钟和800 rpm/min离心8分钟。每次洗涤加入PBS前,应将试管内细胞轻轻摇匀以防结块。
G  二次洗涤后,若发现红细胞污染严重,可直接加入0.5～1.0ml 蒸馏水,处理40秒，立即加入大量的PBS，450g离心5分钟，弃上清液。
H  最后得到的压积淋巴细胞用RPMI-1640或Terasaki液，调整细胞浓度为2×106/毫升备用。
5.2.2.1.5  结果判断
淋巴细胞的纯度：应大于90%。
5.2.2.1.6  质量控制
· 肝素和淋巴细胞分离液使用前应平衡至室温，过冷将影响分离液的比重，造成红细胞污染，并且容易使血小板和淋巴细胞发生聚集。
· 整个分离过程中，应控制温度在22～25℃。
· 尽可能除去血小板，以免影响淋巴细胞毒试验结果。
5.2.2.2  微量淋巴细胞毒试验
5.2.2.2.1  适用范围
HLA-Ⅰ、Ⅱ类血清学分型、供/受者交叉淋巴细胞毒试验等。
5.2.2.2.2  原理
淋巴细胞膜表面具有HLA抗原，HLA特异性抗体与淋巴细胞膜上相应的HLA抗原结合，激活补体，从而改变了细胞膜的通透性，采用染色法着色，染料进入到细胞中；如淋巴细胞不带有相应的抗原，则细胞膜完整，染料无法进入。在显微镜下估计着色细胞的百分比来判断抗原、抗体反应的强度。
5.2.2.2.3  材料与试剂
· 72孔微量淋巴细胞毒实验反应板；
· 兔补体；
· 5%的曙红水溶液；
· 12%的甲醛溶液；
· 倒置相差显微镜 ；
· 单联1微升连续加样器；
· 六联5微升连续加样器。
5.2.2.2.4  步骤与方法
A  在72孔微量反应板中，每孔加石蜡油1滴（8 mL）。
B  每孔加血清1mL，淋巴细胞悬液1mL。
C  22±2℃下，T细胞或混合淋巴细胞孵育30～45分钟，B淋巴细胞放置60～75分钟。
D  每孔加兔补体5mL。
E  22±2℃下，T细胞或混合淋巴细胞孵育60分钟，B淋巴细胞放置120分钟。
F  每孔加入5%曙红溶液2～3mL，染色5分钟。
G  每孔加入12%的甲醛溶液8mL，固定和终止反应。
H  静止4小时以上或过夜，盖上载玻片看结果，紧急情况下可54 g离心判断结果。
5.2.2.2.5  结果判断
读板从1A→1F，然后2F→2A，依次进行，直至12A。在倒置相差显微镜下，被染色的细胞即死细胞，细胞肿胀，无折光能力，呈黑灰色；未被染色的细胞即活细胞，折光能力强，呈光亮状。以NIH方法为准，按照死细胞所占比例来判定每一孔的反应结果（见附表）。根据试剂盒所提供的反应格局表判读HLA血清学分型结果。
微量淋巴细胞毒实验结果判定
        死细胞比例        评分
阴性        1-10%        1
阴性可疑        11-20%        2
阳性可疑        21-40%        4
阳性反应        41-80%        6
强阳性反应        ＞81%        8
5.2.2.2.6  质量控制
·每块反应板应设立阴性对照（阴性对照血清一般采有AB型男性、无受血史者血清）和阳性对照（阳性对照孔中加入了抗淋巴细胞球蛋白），在阴性对照结果为阴性、阳性对照结果为阳性反应时，判读结果。
·兔补体（兔血清）中无天然细胞毒抗体，不引起假阳性反应用。
·石蜡油无毒性。
·为避免每孔细胞不均匀，可用软加法，先将加样器吸一点空气，然后再吸取细胞或试剂。
5.2.2.3  HLA抗体筛选
与移植排斥反应相关的HLA-Ⅰ、Ⅱ类 IgG抗体筛选技术，包括补体依赖淋巴细胞毒方法（CDC）、抗人球蛋白-补体依赖淋巴细胞毒方法（AHG-CDC）、流式细胞仪方法（FCXM）、免疫磁珠方法以及酶联免疫吸附测定方法（ELISA）等，本章节中介绍CDC及ELISA方法。
5.2.2.3.1  适用范围
患者血清中HLA抗体的筛选。
5.2.2.3.2  原理
·补体依赖淋巴细胞毒方法（CDC）：受检者血清中的抗体与供者淋巴细胞表面的HLA抗原相给合后，激活补体，引起供者淋巴细胞细胞膜被破坏，这种抗体称细胞毒抗体。将含有此抗体的血清与供者淋巴细胞、补体共同孵育，淋巴细胞膜被破坏、通透性增加，染料得以渗入，使细胞着色。根据着色的死细胞数量，来估计淋巴细胞细毒的强度。
·酶联免疫吸附测定方法（ELISA）：抗HLA-Ⅰ或Ⅱ类单克隆抗体（抗α-3）包被酶联板孔，并捕获可溶性HLA抗原，从而制成ELISA试剂板。当受检者血清样本中存在抗HLA-IgG抗体时，发生抗原-抗体特异性反应，加入抗人IgG酶联交联剂，发生酶促显色反应。从而检测出样本中是否存在HLA IgG抗体。
5.2.2.3.3  材料与试剂
·补体依赖淋巴细胞毒方法（CDC）：
72孔微量淋巴细胞毒实验反应板；
兔补体；
5%的曙红水溶液；
12%的甲醛溶液；
倒置相差显微镜 ；
单联1微升连续加样器；
六联5微升连续加样器。
·酶联免疫吸附测定方法（ELISA）：见各类商品化试剂盒
5.2.2.3.4  步骤与方法
·补体依赖淋巴细胞毒方法（CDC）：
A  按常规法使用淋巴细胞分离液，分离计划供者的淋巴细胞，并调节2000个/mL。
B  在72孔微量反应板中，每孔加石蜡油1滴（8 mL）。
C  每孔加受检者血清1mL，计划供者淋巴细胞悬液1mL。
D  37℃下，T细胞或混合淋巴细胞孵育30分钟。
E  每孔加兔补体5mL。
F  37℃下，孵育60分钟。
G  每孔加入5%曙红溶液2～3mL，染色5分钟。
H  每孔加入12%的甲醛溶液8 mL。
I  静止或54g离心后在倒置相差显微镜下判断结果。
·酶联免疫吸附测定方法（ELISA）：按试剂盒说明书操作。
5.2.2.3.5  结果判断
·补体依赖淋巴细胞毒方法中，阳性对照中死亡细胞数大于90%，阴性对照死亡细胞数小于2%，表明试验结果可靠。临床一般将细胞毒低于10%作为阴性，大于10%作为移植禁忌。
·酶联免疫吸附测定方法（ELISA）中，应用酶标仪读板。若无酶标分析仪，根据阴性和阳性对照颜色之深浅，观察检测血清的结果；阳性孔为蓝色，阴性孔为无色。
5.2.2.3.6  质量控制
·设立阴性对照和阳性对照。
·加样时，注意避免交叉污染。
5.2.3  HLA基因分型技术操作规程  
5.2.3.1  DNA的提取
DNA提取方法总的原则是应保证DNA一级结构的完整性，同时应排除其它分子的污染。其主要步骤是破碎细胞，去除与DNA结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀DNA，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。
提取DNA若采用商品化试剂盒，操作应按试剂盒说明书进行。在这里仅介绍酚氯仿抽提DNA的方法。
5.2.3.1.1  酚氯仿抽提DNA的原理
DNA以核蛋白的形式存在于细胞核中，它是由4种DNA单体以磷酸二酯键连接而成的长链分子。血细胞破碎后，从核酸样品中去除蛋白质时使用平衡酚和氯仿：异戊醇（24：1）,其中酚能有效地使蛋白质变性，氯仿亦可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离，异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的泡沫。先用酚：氯仿然后再用氯仿抽提，使用两种不同的有机溶剂比用单一有机溶剂效果更佳，而且氯仿抽提可去除残留的痕量酚。然后采用无水乙醇沉淀DNA。
5.2.3.1.2  设备与材料
超净工作台、不同量程的加样器、离心机、混匀器、加热混合器、分光光度计。Tip头、1.5ml Eppendorf管、比色杯。
5.2.3.1.3  试剂
·5% EDTA-Na2·2H2O（pH8.0）:在800ml水中加入50g EDTA-Na2·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0（约需6gNaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
·红细胞裂解液（RCLB）：
蔗糖                        34.24g
1mol/L Tris-HCL(pH7.6)         1ml
1mol/L MgCl2·6H2O            0.5ml
10%  Triton X-100              1ml
dH2O加至100 ml，4℃保存
o白细胞裂解液（WCLB）：
1mol/L Tris-HCL(pH7.6)         1ml
0.5mol/L EDTA(pH8.0)           2ml
NaCl2                       0.292g
dH2O加至100 ml
·DSP储存液
1mol/L Tris-HCL(pH8.0)          1ml
1mol/L KCL                    2.5ml
1mol/L MgCl2·6H2O           0.125ml
dH2O加至50 ml，高压消毒后储于室温。
o DSP工作液(临用前配制)
DSP储存液                     915ml
蛋白酶K（10mg/ml）             80ml
Tween 20                         5ml
o 氯仿：异戊醇（24：1）
o PCL（酚-氯仿-异戊醇）的配制（100ml）：75 ml酚+25 ml氯仿：异戊醇（24：1）；加入15ml的1mol/L Tris-HCL(pH8.0)，混匀；放置至酚层澄清透明；弃去上层液相；加入15ml的0.1mol/L Tris-HCL(pH8.0)，并加入8-羟基喹啉至终浓度为0.1%，充分混匀；放置至酚层澄清透明；弃去上层液相；加入10 ml左右0.1mol/L Tris-HCL(pH8.0)于液面上。将此混合液存放在不透光的试剂瓶中，可于4℃保存1个月。
o 无水乙醇
o 70%乙醇
o TE缓冲液（pH8.0）
1mol/L Tris-HCL(pH8.0)         2.5ml
0.5mol/L EDTA(pH 8.0)          0.5ml
dH2O加至250 ml
5.2.3.1.4  步骤与方法
A  取外周血1ml，加5% EDTA200ml 混匀抗凝；或用ACD抗凝剂抗凝。不能用肝素抗凝，因为肝素能抑制酶的活性。
B  取1.5ml Eppendorf管1支编号后加入500ml抗凝全血，4000rpm离心2分钟，弃上清；加1ml RCLB,颠倒混匀30秒，12500 rpm离心5分钟。
C  弃上层液，在沉淀中加入dH2O 1ml，剧烈混匀并打碎块状物，12500 rpm离心5分钟。
D  弃上层液，加入WCLB液1ml，混匀并打碎块状物，12500 rpm离心5分钟。（此间可配制DSP工作液）。
E  将上层液尽量倾干，加入400ml DSP工作液，混匀并打碎块状物，56℃孵育1h，直至完全消化，摇晃时无气泡产生。
F  加入PCL液800 ml，颠倒混匀至乳化状态，12500 rpm离心5分钟。
G  吸上层液相至另一编好号的1.5ml Eppendorf管，记下吸出量；然后加入等体积的氯仿-异戊醇，振摇抽提后，12500 rpm离心5分钟。
H  吸上层液相至另一编好号的1.5ml Eppendorf管，记下吸出量；然后加入2倍体积的冷无水乙醇，上下颠倒，直至可见DNA絮状析出，12500 rpm离心5分钟。
I  弃上清，在沉淀的DNA中加入1ml 70%乙醇淋洗，12500 rpm离心5分钟。
J  弃上清并扣于吸水纸上片刻，然后离心片刻，用Tip头吸干管底残留的微量液体，注意不要碰到DNA。
K  根据DNA的量加入60～150ml TE缓冲液溶解DNA，用加样器反复吸取吹打混匀，至完全没有未溶解物。加盖后置37℃过夜或60℃ 1h，取出后在4℃储存DNA，若欲长时间存放，于-20℃以下储存。
5.2.3.1.5  DNA 质量鉴定
DNA含量及纯度通常用比色法检定，将DNA取少量稀释后，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上测定OD260 、OD280的值。DNA含量=50ul/ml×OD260值×稀释倍数。纯度= OD260nm/ OD280nm，DNA纯品的OD260/ OD280值为1.8。
5.2.3.2  HLA基因分型方法
以前HLA抗原检测方法一直是淋巴细胞毒试验，进入80年代后期，分子生物学技术的迅速发展与成熟，尤其是PCR技术的建立与发展，以DNA为基础的HLA基因分型技术成为当今实验室常用的检测方法。最常见的方法有：SSP、SS0、SBT等。
5.2.3.2.1  聚合酶链反应-序列特异性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）分型方法
5.2.3.2.1.1  适用范围
临床进行造血干细胞移植及器官移植的患者、亲缘供者、骨髓库无关供者及亲子鉴定样本的HLA-Ⅰ、Ⅱ类基因分型。
5.2.3.2.1.2  原理
根据HLA核苷酸碱基序列的多态性和已知的DNA序列，设计一系列等位基因型别特异性序列引物，通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的型别特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，然后通过凝胶电泳检测PCR产物。根据是否产生特异性PCR产物以及产物的片段大小来指定相应基因型。
5.2.3.2.1.3  设备与材料
不同量程的加样器、微型离心机及平板离心机、混合器、PCR扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪、微波炉。Tip头、1.5ml Eppendorf管、量筒、烧杯、热敏打印纸。
5.2.3.2.1.4 试剂
·HLA-SSP基因分型试剂盒：按试剂盒说明书要求保存。
·Taq DNA聚合酶：在-20℃以下冰箱保存。Taq DNA聚合酶非常粘稠，使用时应缓慢吸取，吸取的Tip头刚刚伸入酶液体液面即可，将Tip头吸附的多余的Taq酶擦到瓶管边缘以避免Taq酶量过多。
·5×TBE：   
Tris碱                     54g
硼酸                      27.5g
0.5mol/L EDTA(pH 8.0)      20ml
磁力搅拌溶于1升ddH2O中。
·琼脂糖
·100×DNA荧光染料SYBR? Green I Nucleic Gel Stain：将1支10000×DNA荧光染料SYBR? Green I Nucleic Gel Stain（50ml）加0.5×TBE 5ml稀释而成，-20℃冰箱保存。
·溴乙锭（5mg/ml）
5.2.3.2.1.5  步骤与方法
以下是SSP方法的基本步骤，具体操作按所使用的试剂盒说明书进行。
A  样本的采集与保存:采集受检者静脉血至少3ml，用EDTA或枸橼酸抗凝,标明姓名及采样日期，一部分于-20℃以下冰箱作为备份标本保存，其余用于提取DNA。
B  基因组DNA提取:采用商品化的DNA提取试剂盒或酚氯仿抽提法均可。DNA纯度OD260nm/ OD280nm比值应在1.6～1.8，根据所用的分型试剂盒的要求来调整模板DNA浓度。
C  CR扩增:反应体系含有特异性引物及内对照引物、PCR buffer（含Mg2+）、dNTP 、Taq酶及模板DNA ,反应体积通常为10～25ml。扩增条件包括DNA变性、退火与延伸三组循环和保温条件。
D  CR产物电泳及照相：2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入0.5mg/ml溴乙锭；电泳缓冲液通常为 0.5×TBE；电泳后在紫外灯下成像。因溴乙锭有毒，目前逐渐被DNA荧光染料取代，电泳前在PCR产物中加1ml 100×DNA荧光染料SYBR? Green I Nucleic Gel Stain，电泳后在蓝光下成像。
5.2.3.2.1.6  结果判断
阴性对照孔应无阳性条带，证实反应体系未被污染；每个反应孔均应出现一条内对照条带，证实反应体系准确无误，当出现另一条扩增条带，且片段大小与对应的反应孔相符，则该条带为特异性扩增条带。通过试剂盒所配的分析软件或通过反应格局表来判读结果。
5.2.3.2.1.7  质量控制
每份检测设立阴性对照，以防止DNA污染出现假阳性；以内对照条带来防止假阴性。
5.2.3.2.1.8  常见问题分析
若无反应带或反应带弱，可能是DNA量不足或存在PCR抑制剂；或是Taq酶量不足；或是EB量不足（0.5mg/ml）。
若有假阳性带，可能是DNA量过多；或是DNA不纯或污染；或是Taq酶量过多。
若阴性孔中出现反应带，可能是DNA污染，或PCR程序输入错误。
若某位点检出两个以上的HLA特异性，而阴性对照孔未被污染时，考虑是样品DNA的污染，必须重新提取DNA，重新分型检测。

秋天de小志

5.2.3.2.2  聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probing PCR-SSO或PCR-SSOP）分型方法
基本原理是采用PCR技术对HLA的多态性区域进行扩增，其产物转移到固相载体上，利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可采用放射性同位素标记，通过放射自显影方法检测；也可用非放射性同位素标记进行相应标记物检测。PCR-SSO技术用于HLA分型主要包括正相SSO方法和反相SSO方法两种,前者是将PCR产物固定在固相载体上，用标记的探针与之进行杂交，后者是将特异性探针固定在固相载体上，用标记的PCR产物与之杂交。下面介绍流式细胞仪反相SSO方法。
5.2.3.2.2.1  适用范围
临床进行造血干细胞移植及器官移植的患者、亲缘供者、骨髓库无关供者及亲子鉴定样本的HLA-Ⅰ、Ⅱ类基因分型。
5.2.3.2.2.2  原理
利用传统PCR-SSO的原理，采用PCR技术对HLA的多态性区域进行扩增，其扩增引物已标记有生物素；生物素化的扩增产物经变性解链后与包被了特异性探针的微珠在一定的条件下进行杂交；经过适当洗脱后加入荧光剂，荧光剂与生物素结合；在一种专用流式细胞仪中检测，这种流式细胞仪可以分析在微珠表面的SSO探针与DNA样品之间的反应情况，获得HLA分型结果。
5.2.3.2.2.3  设备与材料
专用流式细胞仪、不同量程的单道及多道加样器、微型离心机及平板离心机、混合器、PCR扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪、微波炉。96孔PCR扩增板、96孔V型空白板、Tip头、1.5ml Eppendorf管、试剂槽、量筒、烧杯、热敏打印纸。
5.2.3.2.2.4  试剂
流式细胞仪反相SSO基因分型试剂盒通常包括：包被有探针的微珠、位点特异性（组特异性）扩增引物、D-mix溶液、Taq聚合酶 、变性缓冲液、中和缓冲液、杂交缓冲液、洗涤缓冲液、SAPE（荧光剂）、SAPE稀释缓冲液。
5.2.3.2.2.5  步骤与方法
以下是流式细胞仪反相SSO方法的基本步骤，具体操作按所使用的试剂盒说明书进行。
A  样本的采集与保存：同5.2.3.2.1.5 a)。
B  基因组DNA提取：同5.2.3.2.1.5 b)。
C  CR扩增:反应体系含有标记有生物素的位点特异性扩增引物、PCR buffer、dNTP 、Taq酶及模板DNA 。扩增条件包括DNA变性、退火与延伸三组循环和保温条件。扩增后可通过电泳确定扩增质量（2%琼脂糖电泳）。如扩增产物在48小时之内做杂交，可4℃保存；如扩增产物在48小时之后做杂交，则需-20℃保存。
D  变性及中和:准备杂交板，每孔按比例加入变性缓冲液和DNA扩增产物，吹打混匀，一定条件下孵育。然后每孔加入中和缓冲液，吹打混匀。
E  杂交及洗涤:每孔加入包被有探针的微珠与杂交缓冲液，将杂交板密封好后振荡混匀，于PCR仪上按一定条件孵育。孵育后，每孔加入一定量的洗涤缓冲液洗涤，离心后去掉洗涤液，再重复洗涤2次，去掉洗涤液。
F  荧光标记及洗涤:每孔加入荧光剂，密封后振荡混匀，于PCR仪上按一定条件孵育。孵育后，每孔加入一定量的洗涤缓冲液洗涤，离心后去掉洗涤液。
G  上机读板:每孔加入一定量的洗涤缓冲液，吹打混匀后转移到读板上。放入专用流式细胞仪来检测。
5.2.3.2.2.6  结果判断：通过试剂盒所配的分析软件来判读结果。
5.2.3.2.2.7  质量控制：每板所设的阴性对照孔应无HLA等位基因特异性检出，并且每板所加的质控标本分型结果应准确无误才可发出报告。
5.2.3.2.2.8  注意事项:
·微珠及荧光浓缩液均对光敏感，需避光储存。
· 配制荧光浓缩液至少需要在室温下溶解1小时，充分溶解后需要分装在棕色eppendorf管中，存放在4℃冰箱中。
·微珠一旦化冻溶解，需存放在4℃冰箱中。
·杂交过程中严格控制杂交时间；加入荧光缓冲液的时候，充分混匀；实验过程严格注意不要混入杂质。
5.2.3.2.3  DNA测序分型（sequence-based typing SBT）
5.2.3.2.3.1  适用范围
临床进行造血干细胞移植及器官移植的患者、亲缘供者、骨髓库无关供者及亲子鉴定样本的HLA-Ⅰ、Ⅱ类等位基因高分辨水平的基因分型。
5.2.3.2.3.2  原理
DNA 测序技术主要依据 Sanger 的双脱氧链终止法。以 DNA 单链为模板，在特定条件下，用特异的引物在测序级 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，不断将 4 种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3'- 羟基末端并使引物链得到延伸。这种链的延伸是通过引物的 3'- 羟基和脱氧核糖核苷酸底物的 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键来完成的。如果这种反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸 (ddNTP) ，这种 2'3'ddNTP 的 5'- 磷酸基团是正常的 (4 种不同的荧光标记 ) ，而 3' 位置缺少羟基，因此在 DNA 聚合酶作用下，仍然可以通过 5'- 磷酸基团与引物链的 3'- 羟基反应掺入到引物链中，但是由于 ddNTP 没有 3'- 羟基，不能继续与下一个 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。这样，在测序反应体系中， DNA 引物链不断合成与偶然终止，产生一系列有共同的起始点，但终止位置不同的长短不等的核苷酸链，然后将这些反应产物进行电泳，即可得测序图谱。
5.2.3.2.3.3  设备与材料
PCR扩增仪、DNA测序仪（ABI310型、3100型和3730型等）、微型离心机及96孔板离心机2000×g、混合器、移液器和枪头1ml-800ml、用于PCR扩增的反应管或96孔板、分析软件。
5.2.3.2.3.4  试剂
·HLA测序分型试剂盒通常包括：基因特异性PCR混合液（含基因特异性引物、PCR Buffer、dNTPs）、外显子特异性序列混合液（含外显子特异性引物和BigDye Terminators）、Taq DNA聚合酶、ExoSAP-IT（核酸外切酶和小虾碱性磷酸酶的混合物）、NaOAc/EDTA缓冲液、DNA对照品。
·无水乙醇
·TE缓冲液（10mm Tris,0.1mmEDTA,pH8.0）
·琼脂糖凝胶电泳试剂（琼脂糖、溴化乙锭、10×TBE）
·甲酰胺HiDi Formamide(ABI)
·EDTA缓冲液（×10）（用于3100型遗传分析仪）
·POP-6、POP-7胶(ABI)
5.2.3.2.3.5  步骤与方法
以下是SBT方法的基本步骤，具体操作按所使用的试剂盒说明书进行。
A  样本的采集与保存：同5.2.3.2.1.5 a)。
B  基因组DNA提取：同5.2.3.2.1.5 b)。
C  目的基因扩增（PCR反应）：将一定浓度和纯度的DNA与PCR MasterMix和金牌Taq酶的混合液充分混合后，加入到PCR反应孔/管中，进行聚合酶链式反应（PCR反应）。
D  CR扩增产物的鉴定和纯化：PCR反应后，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的质量，然后对PCR产物进行纯化，去除游离的dNTPs和引物。
E  测序反应：将纯化的PCR产物作为模板，分别加入到含有BigDye Terminators测序反应混合液中充分混合后，在热循环仪上进行序列反应。
F  测序反应产物纯化：通过异丙醇沉淀、乙醇/醋酸钠沉淀等方法，去除染料降解产物。
G  自动核酸测序仪电泳：纯化的测序反应样本热变性后，将反应板装载到自动核酸测序仪上进行电泳。
5.2.3.2.3.6  结果分析和判断
通过HLA分析软件对电泳图谱进行分析和准确的判读，得到等位基因水平的分型结果。
5.2.3.2.3.7  质量控制
对阳性对照DNA进行实验，应该得到相应的阳性结果。若得到不同的配型结果，则表明可能存在DNA样本混淆，导致错配。阴性对照的样本，应没有PCR扩增产物产生。若出现阳性结果，则表明可能出现DNA污染。


5.3  血小板血型检测
5.3.1  目的
血小板表面具有复杂的血型抗原，有血小板特异性抗原（HPA-1～16，22个抗原）和血小板相关抗原（ABO血型系统以及HLA-A、B抗原），可免疫产生同种抗体（HPA或/和HLA-A、B抗体），如果供、受者血小板抗原抗体不合，可导致血小板输注无效（PTR）、血小板输注紫癜症（PTP）等输血不良反应。
通过综合利用血小板血清学和基因分型技术可检测血小板同种抗原和抗体（包括HPA和HLA-A、B）的特异性。利用血清学技术对血小板输血反应患者进行血小板抗体筛选，特别是对于有血小板抗体的患者，选择HPA和HLA抗原均相配合的供体血小板，实现临床血小板相容性输注，并逐渐开展血小板同型输注，能避免输血免疫反应的发生，显著提高血小板输注疗效。
目前有不少测定血小板抗体、鉴定血小板抗原以及血小板交叉配合试验的方法，如单克隆抗体免疫固定血小板（MAIPA）抗原技术、单克隆抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术（FCM）、简易致敏红细胞血小板血清学试验（SEPSA）、微柱凝集技术以及基因诊断技术等。现介绍以下几种常用的检测方法。
5.3.2  血清学技术
5.3.2.1  单克隆抗体免疫固定血小板（MAIPA）抗原技术
【适用范围】
可用于鉴定血小板抗原和血小板同种抗体的特异性，检测血小板自身和药物依赖性抗体及血小板表面相关抗体，适宜于广泛开展血小板抗体检查、血小板抗原研究、ITP等自身或同种免疫性血小板减少性紫癜的诊断、治疗、发病机制的研究。
在血小板特异性抗原定型中，因为无商品化血小板HPA定型血清，本法主要用于对部分HPA基因定型结果的验证。
【原理】
先制备羊抗鼠IgG包被的多孔板，另外，将鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体和带有抗体的血小板共同孵育，再将孵育后的复合物加入多孔板，孵育、洗涤，最后加入酶联羊抗人抗体和酶反应底物后显色，定量测定血小板抗体。此方法敏感度高、特异性强。
【器材和试剂】
器材：台式冷冻离心机：使用4×12水平式离心管转头； 微型离心机：使用1.5ml离心管角度式离心管转头；4℃医用冰箱；洗板机；酶标仪；可调加液枪：2～20μl，20～200μl，100～1000μl，均在校准有效期内使用；旋涡振荡器；孔园底和平底微量板。
试剂：血小板洗涤液：0.33% EDTA/PBS, pH7.4；样品稀释液：1% BSA/EDTA/PBS，4℃；TBS 洗涤液；血小板裂解液：Tris1.21g，Nonidet P40 5mL生理盐水1L；抗体稀释液：1% BSA/EDTA/PBS，4℃；鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体GP Ib/IX、GP IIIa、GP IIb、GP IIb/IIIa、GP Ia/IIa、HLA-I 等；羊抗小鼠抗体包被酶标板；碱性磷酸酶标记羊抗人Ig G/A/M；底物缓冲液：30 mmol/L三乙醇胺，1 mmol/L MgCl2；显色底物:对硝基酚磷酸二钠（pNPP）；终止液：95～97%H2SO4； 阳性对照血清；阴性对照血清；HPA血小板定型血清； O型正常机采供者血小板： PAIg、药物抗体筛选用；抗体筛选或鉴定用血小板谱细胞： HPA、HLA-I定型。
【操作步骤】
1)        患者标本采集: 抗凝全血10～20ml (5%EDTA或ACD-A抗凝)，须及时分离出富含血小板血浆；不抗凝全血5～10ml加入到玻璃试管中,置室温2～3小时，离心、分离血清。标本可在2～8℃保存48小时，或-80℃长期保存。
2)        血小板和血清/浆样品制备
(1)        包被准备：在U型微量板每孔中加入羊抗鼠IgG100μl，4℃过夜(或者室温2小时)；检测前30min用TBS洗液洗涤4次；置4℃半小时。
(2)        血小板的准备：全血，用EDTA或ACD-A抗凝，制备的血小板用PBS/EDTA缓冲液重悬至200×109/L左右，4℃储存。
(3)        血小板包被：在U型微量板内加待测血小板100μl/孔，720g离心3min。轻轻倒出上清液，在微量板中分别加入50μl待测血清或血浆液、阴性、阳性对照血清，重悬血小板细胞，37℃孵育30min。每孔加200μlPBS/EDTA液洗板，1100g离心3min。用微量板混合器将血小板重悬，再次洗涤，共3次。
3)        抗原抗体结合：每孔加入鼠抗人单克隆抗体40μl，与血小板混匀，37℃孵育30min，洗板三次，1100g离心3min。
4)        裂解和血小板固相化
(1)        每孔加入125μl溶解液裂解血小板，用吸管混合细胞，然后4℃孵育1小时或过夜。
(2)        微量板在4℃，1600g离心15min，用125μlTBS缓冲液重悬。
(3)        吸取100μl血小板裂解液加入新U型板中。
(4)        每孔加入100μlTBS洗液，37℃孵育90min或者过夜。
5)        酶联反应
(1)        用TBS洗液洗涤微量板4次。
(2)        每孔中加入碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体，4℃孵育90min。
(3)        TBS洗涤微量板3次。
(4)        每孔加入100μl  对硝基酚磷酸二钠（pNPP）底物显色液，在室温避光孵育20min，加入终止液终止显色反应，测定OD410/OD492。
【结果判断、分析和报告】
(1)        计算阴、阳性对照和样品的OD410/OD492均值和S/N值。
(2)        S/N值=样品OD410/OD492 平均值/阴性对照OD410/OD492平均值
(3)        实验可接受性：当NC的OD410/OD492=0.10±0.04，阳性对照S/N≥2。
(4)        样品S/N值≥2，判为阳性；S/N值<2，判为阴性。
(5)        记录样品的OD410/OD492及平均值、S/N值及阴/阳性结果。
(6)        依据以下判断血小板抗原特异性：待检血小板与定型血清(或待检血清与血小板筛检细胞、谱细胞)、单克隆抗体的反应格局；抗原纯合/杂合表型剂量效应；结果报告。
【质量控制】
(1)        每次实验必须设立阴、阳性对照。
(2)        更换不同批号的单抗和酶标抗体后，须作符合性实验。
5.3.2.2  单克隆抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）
【适用范围】
本技术通过检测患者血浆中的血小板同种抗体的特异性，为诊断和治疗免疫性血小板减少性疾病提供可靠依据。临床报告的大多数血小板同种抗体主要是抗HPA-1、-2、-3、-5系统的抗原和抗HLA-I类抗原的抗体。
【原理】
用多聚甲醛固定抗血小板糖蛋白单克隆抗体后，加入待测血清，形成抗原抗体免疫复合物，最后加辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG，用底物邻苯二胺（OPD）显色，根据OD值，判读结果，判断样品有否血小板抗体以及特异性。
【器材与试剂】
器材：同5.3.2.1。
试剂：血小板同种抗体检测试剂盒。
【操作步骤】
(1)        患者标本采集: 抗凝血10～20ml (5%EDTA或ACD-A抗凝)，须及时分离出富含血小板血浆。不抗凝全血5～10ml加入玻璃试管中,置室温2～3小时，离心、分离血清。标本可在2～8℃保存48小时，或-80℃长期保存。
(2)        取出试剂盒，平衡至室温，稀释制备洗涤液。
(3)        取出酶标板条, 每孔加入250μl洗涤液，室温5～10min，倒弃。用样品稀释液1/4稀释阴阳对照和患者样品。
(4)        封板，置37℃培养箱中孵育40min，洗板4次。
(5)        用样品稀释液 1:100稀释抗人 IgG/A/M，每孔加入50μl,封板，置37℃培养箱中孵育40min，洗涤4次。
(6)        稀释PNPP，每孔加入100μl PNPP/酶底物稀释液，H孔不加。室温避光孵育30min。
(7)        每孔加入100μl 终止液，空白对照孔加入200μl 终止液，终止反应。
(8)        测定OD410/OD492。所有对照孔和样品孔的OD值减去空白对照孔的OD值后，记录在实验记录表，用于结果判定。
【结果判断、分析和报告】
(1)        分别计算血清、血小板放散液和阴性对照对某一GP的OD410/OD492平均值：   
S/N =样品OD410/OD492平均值/阴性对照OD410/OD492平均值
S/N≥ 2时，该样品的反应性判为阳性；
S/N<  2时，该样品的反应性判为阴性；
(2)        结果报告。
【质量控制】
每次检测必须设立阴、阳性对照，实验的有效性判断标准为：
        阴性对照        阳性对照
血浆/血清        ≤0.160(GP IIb/IIIa)        ≥1.400
实验孔的OD值的误差须小于双孔OD平均值的20%，超范围的需复检。
5.3.2.4  流式细胞术（FCM）
【适用范围】
可用于血小板相关抗体（PAIgG，PAIgG+IgA+IgM）、血小板自身抗体、血小板药物依赖性抗体和血小板同种抗体的检测，还能用于血小板交叉配血试验，为受血者选择配合的血小板供体。
【原理】
将待检（或受者）血清与荧光标记的血小板谱细胞（或供者血小板）孵育，进行间接免疫荧光标记实验，用流式细胞仪判读反应结果。如反应为阴性，受者血清和供者血小板相容；反之，受者血清和供者血小板不相容。或通过比较待检血清与阴性对照血清的反应格局，判断是否存在血小板抗体。
【器材与试剂】
器材：台式冷冻离心机：使用水平式离心管转头；微型离心机：使用1.5ml离心管角度式离心管转头；可调移液器： 2～20μl，20～200μl，100～1000μl，均在校准有效期内使用；流式细胞仪；  一次性塑料试管： 12×75mm，流式细胞仪用；
试剂：血小板洗涤液：0.33% EDTA/PBS, pH7.4；荧光抗体稀释液：1% BSA/EDTA/PBS，4℃；荧光抗体 FITC-标记山羊抗人IgG Fc； 荧光抗体对照 FITC-标记山羊抗小鼠IgG； 阴性对照血清/浆： AB型，3～4人份混合；阳性对照血清；PC PAK；HLA-A、B阳性血清（ALG），或抗GP Ib/IX或抗GP IIb/IIIa的血小板抗体；鞘液： DPBS，pH7.4， 0.1% NaN3 防腐，0.22μm过滤，室温保存；二甲基亚砜(DMSO):  G5玻沙漏斗过滤，分装20 ml/瓶，室温避光保存。
【操作步骤】
(1)        标本的采集与处理：抗凝全血标本10～20ml（含5%EDTA  0.3ml），血小板计数不低于5×10 9 /L； 不抗凝全血5～10ml。
(2)        血小板和血清/浆样品制备。
(3)        患者血清/浆用于配合实验、患者血小板用作自身对照。
(4)        血小板相容性配合试验-受者血清与供者血小板反应（或血小板抗体检测试验-患者血清与正常供者或谱细胞血小板反应）。
(5)        阴、阳性对照血清/浆和受者（或待检）血清/浆在12000g离心5～10min，取上清液用于实验。
(6)        转移供者血小板（或谱细胞血小板）2×106（体积约20μl）于7～10支标记的12×75mm塑料试管中，分别加入100 μlPBS对照、阴性对照、阳性对照、受者（或待检）血清。
(7)        血清与血小板混合后，于室温孵育1小时。
(8)        用血小板洗涤液离心洗涤3次，2000g离心5min。  
(9)        加入100μl 荧光抗体(1/50～100稀释)，室温暗处孵育30min。
(10)        用血小板洗涤液离心洗涤2次，分散血小板扣，加入 1ml EDTA/PBS悬浮，放置于室温暗处2小时以内上机测定。
【样品检测】
(1)        用空白对照样品管作格式化散点图(Format Dot Plot)和格式化直方图(Format Histogram Plot)，在散点图(Dot Plot)上勾画出设置血小板的区域门，在格式化直方图中设立相应的标志，进行分析。
(2)        其余的样品-阴、阳性对照，受检样品的数据处理在格式化直方图中设置相应的标志, 即可进行统计分析。
【结果判断、分析和报告】
1)        结果计算
(1)        记录各个阴、阳性对照管和每组每个实验管的平均荧光强度（MFI）。
(2)        计算阴性对照的平均值：计算阴性对照组血清的MFI平均值,作比较标准。
(3)        实验结果的可接受判断：各阴性对照管的MFI值无异常偏离，阳性对照MFI值大于阴性对照MFI平均值的2倍，判为质控合格，本次实验的结果可接受。阳性对照无阳性结果，判为质控不合格，本次实验的结果不可接受，必须重作。
2)        结果分析
(1)        S/N = 受检样品的MFI平均值/阴性对照MFI平均值
(2)        受检样品的S/N ≥2倍，判为阳性，即受者血清和供者血小板不相容或待检血清中血小板抗体的反应性为阳性。
(3)        受检样品的S/N < 2倍，判为阴性，即受者血清和供者血小板相容或待检血清中血小板抗体的反应性为阴性。
(4)        受者自身对照组的结果，应结合受者近期是否有血小板输注作出判断。
3)        结果报告。
【质量控制】
(1)        流式细胞仪必须定期校准，并保存校准记录。
(2)        每次实验必须设置阴、阳性对照；阴性对照需用3～4例AB型、无免疫史的健康男性供者血清分别与血小板反应，取平均值作为判定依据。阳性对照MFI值必须大于阴性对照MFI平均值的2倍，实验结果可以接受。
(3)        一般应该有受者的自身对照组，即自身血小板与自身血清反应。如无，则评估结果时必须更加谨慎。
(4)        质控不合格的结果，必须尽快分析原因，纠正后，尽快安排复检。
5.3.3  基因分型技术
5.3.3.1  聚合酶链式反应序列特异引物分型技术（PCR-SSP）
【适用范围】
最简单常用的测定血小板抗原等位基因的方法，可用于单采血小板供者HPA抗原基因分型，建立已知型血小板供者库，开展血小板同型（或配合型）输注；临床患者血小板HPA抗原基因分型；诊断血小板抗原同种免疫引起的新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、免疫性血小板输注无效。
【原理】
根据HPA基因序列设计一套特异性针对各种等位基因的引物，直接扩增有序列差异的各等位基因特异性片段，PCR产物凝胶电泳以后，紫外线透射来检测DNA条带的存在或缺失即可确定基因型。 PCR-SSP操作比较简单，耗时较短，适合小批量标本，是目前HPA基因定型中最常用的一种技术。
【器材与试剂】
器材：可调式移液器：0.01～2.5μl，2～20μl，20～200μl，100～1000μl，均在校准有效期内使用；台式高速离心机：转速可达15000g，使用1.5ml离心管角度式离心管转头；干热器或其它可调温的孵育装置；PCR扩增仪；电泳仪；紫外凝胶成像仪。
试剂：HPA基因分型试剂盒：有PCR引物混合液和TD缓冲液（稀释Taq酶），试剂盒直接或分装后，在－20℃以下保存；Taq酶；100bp DNA 分子量内标：室温保存。
【操作步骤】
1)        标本采集及处理：采集5ml静脉血，用5%EDTA抗凝，5%EDTA与血的比例为1：5，充分混匀，必要时分装，保存在－20℃以下冰箱。
2)        DNA抽提：采用试剂盒抽提DNA，具体的操作方法可见厂商说明书。
3)        引物分装：分装引物后，立即加入石蜡油8μl，以防止引物挥发，分装结束后，置－20℃以下冰箱中保存。
4)        PCR扩增：具体操作见厂商说明书。
(1)        取分装有引物混合物PCR反应板，作好标记。
(2)        另取一干净的 0.5 ml 离心管，加入抽提好的 DNA 溶液，再加入Taq 酶，注意每次吸样均换上干净的tip头，最后再加入适量无菌蒸馏水（根据DNA浓度而定）。
(3)        充分混匀，至少混匀2 次。
(4)        该混合液分装于上述已装有引物混合物PCR反应板，1000g离心0.5 min。
(5)        置于 PCR 扩增仪上，按所设置的 PCR 扩增条件下扩增。
4)        电泳
(1)        琼脂糖凝胶浓度2％，电泳缓冲液用TBE或TAE，加入溴乙淀至终浓度为 0.5 μg/ml。
(2)        吸10 μl扩增好的待检样品于凝胶板的加样孔内，最后一孔为分子量标记物，接好电源，加样孔在负极，电泳迁移方向朝正极，以 8v/cm（电极丝间直线距离）电泳 30 min左右，取出后置于紫外光下检测并照相。
(3)        根据反应格局表，判断结果。在DNA分子量标准对照下，除内对照条带外，出现另一条带为阳性，未出现者为阴性。
【质量控制】
(1)        对同一厂家不同批号的试剂或同一批号不同时间分装的试剂，如HPA基因分型引物、Taq酶等，在使用前均需用已知基因型样品做预试验，以选择一个最佳的使用浓度范围。
(2)        血小板HPA分型操作的全过程应严格遵守防污染的规章制度。每次实验前，必须开紫外线消毒1小时，然后关闭紫外灯，抽气30分钟。每次实验后，作常规工作区清洁，清理废弃物。打开紫外灯，消毒1小时。
(3)        使用同步扩增的429bp、796bp的 HGH基因片段作为内部对照和扩增体系质控。